Method Article

Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

DOI:

10.3791/1863

⸱

March 24th, 2010

 ,  , 
1Department of Biological Sciences and Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

In This Article

Summary

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Gene Löschungs-und Protein-Überexpression sind gängige Methoden zur Untersuchung von Funktionen von Proteinen. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für die Analyse der Phänotyp Entwicklung als eine Funktion der Protein-Konzentration in der Bevölkerung und Single-Cell-Ebenen in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

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Gene Löschungs-und Protein-Überexpression sind gängige Methoden zur Untersuchung von Funktionen von Proteinen. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für die Analyse der Phänotyp Entwicklung als eine Funktion der Protein-Konzentration in der Bevölkerung und Single-Cell-Ebenen in

Protocol

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A. Zellkultur und Protein Induction

Dieser Abschnitt beschreibt Zellkulturbedingungen, Zellzyklus-Synchronisation mit Nocodazol, durch Induktion der Proteinexpression von einem regulierbaren Promotor in Hefe-Zellen gefolgt.

  1. Die Wildtyp-Hefestamm W303 (leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) ist mit hoher Kopienzahl (2μ) Plasmid-DNA, die unsere Gen von Interesse (ENTH2) enthält unter der Kontrolle verwandelt eines Methionin-repressible Promotor (MET25). 2mM Methionin ist ausreichend, um die Promotoraktivität zu unterdrücken, während Medien fehlt Methionin ermöglicht maximale Expression. Somit kan....

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Discussion

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Dieses Protokoll beschreibt, wie die Entwicklung eines morphologischen Phänotyp (Hefezelle nicht korrekte Zellteilung) auf Protein-Überexpression zu überwachen. Wenn Sie dieses Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, um Hefezellen durch Pelletierung bei der empfohlenen Zentrifugationsgeschwindigkeit als höhere Geschwindigkeiten Zellen und obskuren Ergebnisse Schäden können zu ernten. Methylenblau und Calcofluor weiß sollte hinzugefügt werden, um Zellen kurz vor der Bildgebung leben, wie sie giftig sind. Dieses.......

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Acknowledgements

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Wir danken Brian G. Coon und Claudia B. Hanna für hilfreiche Diskussionen und Unterstützung. Dieses Projekt wurde durch eine Anschubfinanzierung aus dem Dep unterstützt. of Biological Sciences, Purdue University zu R. Claudio Aguilar und ein American Cancer Society Institutional Research Grant R. Claudio Aguilar durch die Purdue Cancer Center.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
NocodazolReagenzSigma-AldrichM1404
Methylenblau 1% (w/v)ReagenzVWR internationalVW6276-0
Calcofluor WeißReagenzSigma-AldrichF3543
VaselineReagenzVWR internationalVW3339-2

References

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  1. Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).
  2. Gietz, R. D., Woods, R. A.

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Protein ConcentrationMorphological PhenotypeBudding YeastWestern BlottingMicroscopy AnalysisTime Lapse VideoSeptin MislocalizationCell Division DefectMethionine Repressible PromoterAgrose Bed Preparation

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