Die Genauigkeit und Empfindlichkeit der Protein-Bestimmung durch die schnelle und bequeme Bradford Assay wird durch intrinsische Nichtlinearität beeinträchtigt. Wir zeigen eine einfache Linearisierung Verfahren, das erhöht die Genauigkeit, verbessert die Sensitivität des Tests zu 10-fach, und reduziert Störungen durch Reinigungsmittel.
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Methodenartikel
Linearisierung der Bradford Protein Assay
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Bestimmung von Mikrogramm-Mengen des Proteins in der Bradford Coomassie Brilliant Blue Assay wird durch Messung der Absorption bei 590 nm erreicht. Das häufigste Assay ermöglicht die schnelle und einfache Proteinquantifizierung in Zelllysaten, Zellfraktionen oder rekombinantes Protein-Proben, zum Zweck der Normalisierung der biochemischen Messungen. Doch Kompromisse eine intrinsische Nichtlinearität der Empfindlichkeit und Genauigkeit dieser Methode. Es wird gezeigt, dass unter normalen Testbedingungen, das Verhältnis der Absorptionsmessungen bei 590 nm und 450 nm streng linear mit Protein-Konzentration ist. Dieses einfache Verfahren erhöht die Genauigkeit und verbessert die Sensitivität des Tests zu 10-fach, erlauben die Quantifizierung bis zu 50 ng Rinderserumalbumin. Darüber hinaus ist die Störung häufig von Reinigungsmitteln verwendet werden, um den Zelllysaten erstellen eingeführt stark durch das neue Protokoll reduziert. Eine lineare Gleichung auf der Basis von Massenaktionen und Beer-Gesetz entwickelt passt perfekt zu den experimentellen Daten.
Protokoll
Linearisierung der Bradford Protein Eichkurve:
Die Coomassie Brilliant Blue-Protein-Assay, die gemeinhin als Bradford-Assay 1 bekannt, ist weithin wegen seiner schnellen und komfortablen Protokoll sowie die relative Empfindlichkeit eingesetzt. Leider gibt es ein großes Maß an Krümmung über ein breites Spektrum von Protein-Konzentrationen (Abb. 1). Daher ist nur ein schmales Spektrum von relativ hohen Protein-Konzentrationen, 2-10 mg / ml BSA, für die Eichkurve, die dann besser passt lineare Regression (Abb. 1, grün) verwendet. Allerdings erfordert die Nichtlinearität Proteinkonzentration der unbekannten Proben innerhalb der begre....
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Diskussion
Die Bradford-Protein-Assay ist beliebt wegen seiner einfachen Leistung und relative Empfindlichkeit. Die Linearisierung über den gesamten Protein-Konzentrationen Bereich durch das Protokoll erhalten hier vorgestellten weiter vereinfacht den Test, wie die unbekannten Proben müssen sich nicht innerhalb des Bereiches der Eichkurve fallen.
Wichtig ist, dass die verbesserte Protokoll weiteren bietet die folgenden Vorteile gegenüber dem ursprünglichen Bradford-Protokoll:
- Erhöhte Genau.......
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Danksagungen
Dieses Papier ist dem Andenken des verstorbenen Dr. Zvi Selinger, der das Original hier beschriebenen Untersuchungen gehostet gewidmet.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Bradford-Reagenz | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Rinderserumalbumin | Amersco | 0332 | |
| Mikrotiterplatten-Absorptionsreader | BioTek | Synergy2 |
Referenzen
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G.
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Nachdrucke und Genehmigungen
