Immunzytochemische Analyse von menschlichen pluripotenten Stammzellen mit Hilfe eines Self-Made Cytospin Apparatus

Summary

Suspension immunzytochemische Färbung von menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) für Zell-Oberflächen-Marker (SSEA-3/SSEA-4) wurde basierend auf der Verwendung einer self-made Zytospin Apparat zu einer Monoschicht von Zellen für die Beobachtung und Quantifizierung erstellen erreicht.

Abstract

Menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs), dass menschliche embryonale Stammzellen (hES) und der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) enthalten, werden spannende Zellquellen aufgrund ihrer grenzenlosen Selbst-Erneuerung Fähigkeiten und ihr Potenzial, in verschiedenen Zelltypen zu differenzieren. Die pluripotenten Zustand hPSCs ist in der Regel durch Techniken wie qPCR, Immunzytochemie beurteilt und von anderen

Protocol

Teil 1: Die Aussetzung immunzytochemische Färbung

1. Die Zellen werden in einer einzigen Zellsuspension geerntet.
2. Die Zellen werden dann in 1,5-2ml Reaktionsgefäße überführt und zentrifugiert bei 200g für 4 Minuten.
3. Die Zellen werden durch Absaugen aus Überstand gewaschen, in 1 ml PBS resuspendiert - (ohne Mg ^{2 +} und Ca ^{2 +)} und dann wieder bei 200g für 4 Minuten zentrifugiert. Dies sollte zweimal durchgeführt werden.
4. Nach dem Waschen werden die Zellen dann durch Resuspendieren sie in 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) bei Raumtemperatur für 10 Minuten fixiert.
5. Die Zellen werden erneut zweimal mit 1 ml PBS gewaschen -.
6. Nach dem Waschen, Block-Zellen durch Resuspendieren sie in 1-ml-Block-Lösung (6% serum/94% PBS -). Inkubieren diese bei Raumtemperatur für 45 Minuten.
7. Nach, Zentrifugenröhrchen bei 200g für 4 Minuten und saugen aus Block-Lösung. Re-suspend-Zellen in 1 ml des primären Antikörper-Lösung (hergestellt mit Block-Lösung in der empfohlenen Verdünnung). Die Zellen können entweder bei Raumtemperatur für 1 Stunde oder bei 4 ° C über Nacht, bevor Sie den nächsten Schritt inkubiert werden.
8. Die Zellen werden dann zweimal mit 1 ml Block-Lösung gewaschen.
9. Nach, resuspendieren Zellen in 1 ml des sekundären Antikörper-Lösung (hergestellt mit Block-Lösung in der empfohlenen Verdünnung) und Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
10. Nach 1 Stunde, sollten die Zellen dann wieder zweimal mit 1 ml Block-Lösung gewaschen.
11. Nach dem Waschen mit Block-Lösung, waschen Sie die Zellen wieder mit 1ml PBS -.
12. Nach den verschiedenen Waschungen wieder auszusetzen Zellen in 1ml von DAPI Kernfärbung (1:10000 Verdünnung von DAPI in PBS -) und Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
13. Nach 5 Minuten Zentrifugenröhrchen bei 200g für 4 Minuten. Saugen Sie die DAPI Kernfärbung Lösung und resuspendieren Zellen in 1 ml PBS -.

Teil 2: Der Einbau von hPSCs in gleitet durch Zytospin Vorrichtung erzeugt

1. Kunststoff Folien sind, indem sie die gewünschte Menge Löcher in ihnen mit einer Bohrmaschine vorbereitet. Der Durchmesser muss in den meisten 1mm größer als der größte Durchmesser der Mikropipette Spitze (n) verwendet werden.
2. Filterpapier ist es, die Parameter der Kunststoff-Objektträger mit der Schere geschnitten.
3. Die Löcher werden dann in den Filter-Papier. Die Größe der Bohrung (en) sollte groß genug sein, dass die Mikropipette Spitze (n) snuggly passt durch.
4. Nach einer der vorbereiteten Folien aus Kunststoff ist auf der Oberseite und einem Glasträger in an der Unterseite des Schnittes Filterpapier (Abbildung 1) platziert. Die Schichten sind mit Klebeband befestigt.
5. Es können maximal 100 &mgr; (abhängig von der gewünschten Monoschicht Dichte) der angefärbten Zellsuspension aus Teil 1 wird dann in der Spitze der Mikropipette Spitze (n) platziert.
6. Falls erforderlich, kann das Gerät mit Zell-Lösung gewogen und ein Gegengewicht von ähnlichem Gewicht geschaffen.
7. Die Zytospin Apparate und Gegengewicht können, sind dann in einem Desktop-Zentrifuge gegeben und zentrifugiert bei 200g für 4 Minuten.
8. Nach dem Zentrifugieren wird die Zytospin Apparat sorgfältig in einer Weise, verdrängen die Zellen aus dem Glasträger doesnt demontiert.
9. Wenn nötig, überschüssige umliegenden PBS - auf Glasseite in abgesaugte.
10. Die Zellen können dann eine Anzeige mit einem Fluoreszenz-Mikroskop zu überprüfen, ob die gewünschte Zellmonolayer erreicht worden ist.

Teil 3: Anschluss Dias

1. Ein Tropfen der gewünschten Montage Medien direkt in der Mitte jeder Bereich mit mehreren Zellen gelegt.
2. Nach, ist ein Deckglas vorsichtig auf die Dias versucht, um Luftblasen zu vermeiden, wenn möglich, gesenkt werden.
3. Überschüssiges Eindeckmittel wird dann von Dias entfernt.
4. Nach, sind die Seiten der Deckgläser mit Nagellack versiegelt.
5. Die Folien können in einem dunklen Lagerraum aufbewahrt werden, bis Ergebnisse beobachtet und dokumentiert werden.

Discussion

Für die Zwecke unseres Labors, ist ein 35-mm-Schale von Stammzell-Kulturen auf embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) gewachsen für die immunzytochemische Färbung Verfahren für den Einsatz mit dem Zytospin Apparat zugeteilt. Die Zellen werden dann mit Hilfe von enzymatischen Passagieren gesammelt, die Beseitigung so viel von der MEF-Schicht wie möglich, in einen Ein-Zell-Suspension. Wenn effektiver Stammzellen isoliert von der MEF-Schicht gewünscht wird, kann Kolonien manuell kommissioniert dann verdaut in Suspension. Wen...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab Tek Permanox Kammer-Objektträger	Thermo Fisher Scientific, Inc.	117437	Material für wiederverwendete Objektträger
Superfrost/Plus Objektträger Vorgereinigt	Fisher Scientific	12-550-15
0,1-10μ L Filterspitzen	USA Scientific, Inc.	1121-3810
Mikroskop Deckglas	Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280	Richard-Allan Scientific	8311-4	Eindeckmedium
DPBS	GIBCO, von Life Technologies	14190
Normales Ziegenserum	Invitrogen	10000C
Maus Anti-SSEA-4 Monoklonaler Antikörper	EMD Millipore	MAB4304	Primärer Antikörper für die SSEA-4-Färbung
von Ratten Anti-SSEA-3 Monoklonaler Antikörper	EMD Millipore	MAB4303	Primärer Antikörper für die SSEA-3-Färbung
Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus	IgG Invitrogen	A11029	Sekundärer Antikörper für die SSEA-4-Färbung
Alexa Fluor 488 markierte Ziege Anti-Ratten-IgG	Invitrogen	A11006	Sekundärer Antikörper für die SSEA-3-Färbung
DAPI, Dihydrochlorid	Calbiochem	268298