Method Article

Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) Assay für Protein-Protein-Wechselwirkungen in Onion Zellen unter Verwendung des Helios Gene Gun

DOI:

10.3791/1963

⸱

June 12th, 2010

 , 
1Dept. Of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

In This Article

Summary

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Dieser Artikel veranschaulicht, wie man richtig mit dem BioRad Helios Gene Gun, um Plasmid-DNA in Zwiebel Epidermiszellen einzuführen und wie man für Protein-Protein-Interaktionen in Zwiebel-Zellen auf dem Prinzip der bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) basierter Test

Abstract

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Untersuchung von Genfunktionen in verschiedenen Organismen beruht auf Wissen, wie die Genprodukte miteinander interagieren in ihren normalen zellulären Umgebung. Die bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) Assay

Protocol

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I. Plasmidpräparation

Die Plasmid-DNA für die Bombardierung verwendet werden, müssen von hoher Reinheit und in einer Konzentration von 500ng/μl oder größer sein. Für BIFC mit zwei Plasmid-Konstrukte, 25 ug jedes Plasmid benötigt. In anderen Worten, sollte molaren Verhältnis von 1:1 der beiden Plasmiden gemischt steigen auf 50 ug Gesamt-Plasmid-DNA zu geben für die Herstellung von Patronen werden. Seien Sie aufmerksam, dass das Hinzufügen mehr DNA als 50 ug kann die Agglomeration der Goldpartikel verursachen und sollten vermieden werden. Kommerziell erhältliche Plasmid-DNA-Extraktion Kits für die Isolierung von Plasmid-DNA zu empfehlen.

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Discussion

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  1. Bei erstmaliger Benutzung, empfehlen wir üben das gesamte Verfahren von Cartridge Vorbereitung auf Beobachtung, mit einem einzigen Plasmid konstitutiv Reporter wie 35S:: GFP oder 35S:: GUS. Wir verwendeten einen 35S:: GFP-Plasmid von Drs. erhalten. Steve Berg und Xiaoning Zhang 6 (Abbildung 1A, D). Das Gen Schuss Patronen, bei RioRad (Cat 165-2244) verkauft werden, sind nicht geeignet für Pflanzen.
  2. Für BIFC, wird eine zweite positive Kontrolle erforderlich, die sich von zwei bekannten Interaktionspartner, fusionier.......

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Disclosures

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

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Wir danken Drs. Steve Berg und Xiaoning Zhang für die 35S:: GFP pGlowbug konstruieren und die Hokensen Promotionsstipendium für CH Research in Z. L's Labor ist von der US National Science Foundation (IOB0616096 und MCB0744752) unterstützt. ZL wird teilweise durch die University of Maryland Agricultural Experiment Station unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Gelbe ZwiebelBeliebig Lieferant
Helios Gene GunBio-Rad
Fluoreszenzmikroskop mit entsprechenden Filtern für GFP oder YFPZeiss, Nikon, Olympus

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
  2. Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z.

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Bimolecular Fluorescence ComplementationProtein Protein InteractionOnion Epidermal CellsHelios Gene GunFluorescence MicroscopyPlasmid BombardmentGold Particle CoatingSEU LUH InteractionYFP Fluorescence DetectionNegative Control Assay

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