Schlüssel zum Verständnis der morphogenetischen Prozesse, die der frühe Embryo Form ist die Möglichkeit, Bild-Zellen in hoher Auflösung. Wir beschreiben hier eine Methode zur Kennzeichnung einzelner Zellen oder kleine Gruppen von Zellen in ganzen Zebrafisch-Embryos mit Membran-bezogene Green Fluorescent Protein.
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Methodenartikel
Labeling und Imaging Cells in der Zebrafisch Hinterhirn
In diesem Artikel
Erratum-Hinweis
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Schlüssel zum Verständnis der morphogenetischen Prozesse, die die frühen Wirbeltierembryo Form ist die Möglichkeit, Bild-Zellen in hoher Auflösung. In Zebrafisch-Embryos, Injektion von Plasmid-DNA führt zu Mosaik-Ausdruck, so dass für die Visualisierung von einzelnen Zellen oder kleine Gruppen von Zellen
Protokoll
1.Microinjection
- Verdünnen Plasmid kodiert Membran gezielte Green Fluorescent Protein (mGFP, mit freundlicher Genehmigung von Richard Harland) zu einer Konzentration von 40 ng / ml. DNA wird durch Linearisierung Plasmid (mGFP/PCS2 +, mit freundlicher Genehmigung von Richard Harland) unter Verwendung des Qiagen Maxi Prep Kit vorbereitet. Die Zugabe von Phenolrot (verwässert 1 / 10 Volumen), um die Lösung bevorzugt, die Lösung zu visualisieren. Keep DNA-Lösung auf Eis.
- Unter einem Stereomikroskop, kalibrieren Sie die Injektionsnadel (90mm Glaskapillaren aus Narishinge Scientific; Kat.-Nr. NA-GD-1), indem Sie die Nadel auf einer abgestuften Rutsche ....
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Diskussion
Abschließend beschrieb die Kennzeichnung Techniken hier erlauben einzelne Zelle Analyse von morphogenetischen Prozesse im Zebrafisch Embryo. Der primäre Schwerpunkt dieses Protokoll wird auf Methoden zur Darstellung von markierten Zellen in das Neuralrohr mit mGFP unter der Kontrolle eines ubiquitären Promoters. Weitere Anwendungen dieser transiente Expression Assays sollte sich der Leser zu einer neueren Arbeit von Andersen et al verweisen. 3.
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch ein NIH Zuschuss für R. Brewster (1R01GM085290-01A1) unterstützt.
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Materialien
Lösungen
- Hank Stock # 1: 8,0 g NaCl, 0,4 g KCl in 100 ml dd H 2 O
- Hank Stock # 2: 0,358 g Na 2 HPO 4 Wasserfreies, 0,60 g KH 2 PO 4 in 100 ml ddH 2 O
- Hank Stock # 4: 0,72 g CaCl 2 in 50 ml ddH 2 O
- Hank Stock # 5: 1,23 g MgSO 4 x7H 2 O in 50 ml dd H 2 O
- 1 X-Phosphat-Puffer: 0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,02 M PO4, pH 7,3
- Blocking Solution: 2% normalem Ziegenserum, 1% Rinderserumalbumin (BSA), 1% Dimethylsulfoxid (DMSO)
Referenzen
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish Practical approach series. , Oxford University press. (2002).
- Hong, E., Brewster, R. N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish. Development. 133, 3895-3905 (2006).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M.
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain
Posted by JoVE Editors on 9/16/2010. Citeable Link.
A correction was made to Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain. There was an error in the authors affiliations. The authors have been corrected to:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster1
1Department of Biological Sciences, University of Maryland, Baltimore County
2Center for Neuroscience, Children's National Medical Center
instead of:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster2
1Center for Neuroscience, Children's National Medical Center
2Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County
