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Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Sarasija und Norman, Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
>1. Wachstum und Synchronisation der Nematodenpopulation
Diese Tiere erreichen das L4-Larvenstadium nach ~42 h. Zu diesem Zeitpunkt werden die L4-Larven mit einem Platinpickel auf OP50-NGM-Platten mit 0,5 mg/ml 5-Fluor-2'-Desoxyuridin (FUdR) gebracht, um zu verhindern, dass sie Nachkommen produzieren.
HINWEIS Stellen Sie sicher, dass innerhalb eines Experiments alle Stämme für einen ähnlichen Zeitraum synchronisiert sind. Die FUdR-Behandlung sterilisiert die Tiere und verhindert die Eiablage und die Nachkommenproduktion, was die OCR beeinflussen könnte. Diese sterilisierten Tiere werden am nächsten Tag (Tag 1, adulte Tiere nach ~66 h) für den Assay analysiert. Es wurde berichtet, dass FUdR die Physiologie und Lebensdauer bestimmter mutierter Würmer beeinflusst. Daher sollte dies berücksichtigt werden, wenn das Medikament zur Sterilisation verwendet wird. Würmer können auch mit Hilfe von feminisierenden Mutationen wie fem-1(hc17) oder fem-3(e2006) sterilisiert werden. Diese Mutationen können sich jedoch auf die mitochondriale Funktion auswirken.
- Übertragen Sie L4-Larven mit gewünschtem genetischen Hintergrund (z. B. N2 [Wildtyp] und Sel-12-Tiere) auf Nematoden-Wachstumsmedien (NGM)-Platten (siehe Tabelle 1 für das Rezept), die frisch mit einem Rasen von Escherichia coli (OP50) besät wurden. Verwenden Sie mindestens zwei 100-mm- oder drei 60-mm-Platten für jeden Stamm. Inkubieren Sie die Würmer bei der entsprechenden Wachstumstemperatur (zwischen 15–25 °C) für 3–4 Tage oder bis die Platten mit einer großen Anzahl von Eiern und trächtigen Würmern konzentriert sind.
- Waschen Sie die Eier und Würmer von den Platten mit ca. 6 ml M9-Puffer (Rezept siehe Tabelle 1) pro 100-mm-Platte Nematoden und überführen Sie sie mit Pasteur-Glaspipetten in einzelne 15-ml-Zentrifugenröhrchen für jeden Stamm. Drehen Sie diese Röhrchen 3 Minuten lang bei 6.180 x g herunter und saugen Sie den M9-Puffer ab, wobei nur die Tier- und Eierpellets erhalten bleiben.
- Geben Sie 3–4 ml Bleichlösung (siehe Tabelle 1 für das Rezept) in jedes Röhrchen und wirbeln Sie es intermittierend für 6 min. Fügen Sie M9-Puffer hinzu, um jedes Röhrchen zu füllen, und drehen Sie es 1 Minute lang bei 6.180 x g und aspirieren Sie den Überstand. Wiederholen Sie diese Wäsche mit M9 dreimal und geben Sie das Eipellet in ein frisches 15-ml-Röhrchen mit ca. 9 mL M9-Puffer
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- Synchronisieren Sie die frisch geschlüpften Würmer, indem Sie 16–48 h bei 20 °C nutieren. Schleudern Sie diese Röhrchen 1,5 min lang bei 6.180 x g herunter und legen Sie die synchronisierten L1-Tiere auf einzelne NGM-Platten, die frisch mit einem Rasen von OP50 besät wurden (ca. 6.000–10.000 Tiere pro 100 mm Platte) und halten Sie sie bei 20 °C.