Sphäroiderzeugung aus Zelllinien: Eine dreidimensionale (3D) Zellkulturmethode

Zusammenfassung

Quelle: Dillard, P., et al. A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells. J. Vis. Exp. (2018).

Sphäroide sind eine Art von 3D-Zellkulturmodell, das verwendet wird, um die Umgebung einer Zelle im Vergleich zu 2D-Zellkultur-Monolayer-Modellen genauer darzustellen. Im Beispielprotokoll werden wir sehen, wie Wissenschaftler Sphäroide aus einer Darmkrebszelllinie erzeugen und Lebendzell-Imaging anwenden, um das Wachstum der Sphäroide zu verfolgen.

Protokoll

>1. Erzeugung von Sphäroiden aus kolorektalen Krebszelllinien

1. HCT 116 (stabil transduziert, um Cluster of Differentiation 19 (CD19) und Green Fluorescence Protein (GFP)) Zellmonoschichten mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 5 mL für einen 25 cm² oder 10 mL für einen 75 cm² Kolben) zu waschen. Trypsin (0,5 mL für einen 25 cm 2 oder 1 mL für einen 75 cm² Kolben) zugeben und die Zellen 5 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
2. Überprüfen Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop und neutralisieren Sie das Zelldissoziationsenzym mit vollständigem Roswell Park Memorial Institute 160 Medium (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + Gentamycin; 10 mL für einen 25 cm² oder 20 mL für einen 75 cm² Kolben).
3. Zentrifugieren Sie die Zellensuspension bei 500 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie sie, indem Sie mehrmals mit 5 mL des vollständigen Mediums RPM1 1640 auf und ab pipettieren.
4. Zählen Sie Zellen mit dem Trypanblau-Ausschluss auf einem kompatiblen Zellzähler.
5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie ihn in RPMI-Medium, um 5 x 10³Zellen/ml zu erhalten.
6. Eine runde 96-Well-Bodenplatte wird 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 100 μl/Well 100 μg/ml Poly-L-Lysin (PLL) in PBS bestreut. Zweimal mit PBS waschen und den Teller trocknen lassen.
7. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles Reservoir und dosieren Sie 200 μl/Well mit einer Mehrkanalpipette in die PLL-beschichteten 96-Well-Rundbodenplatten.
8. Die Platte wird in einem Inkubator (37 °C, 5 % CO₂, 95 % Luftfeuchtigkeit) in das automatisierte Bildgebungsgerät überführt.
9. Melden Sie sich bei der Erfassungssoftware an und wählen Sie "Zeitplan für die Erfassung" | "Starten zum Hinzufügen eines Schiffes" | "Scannen nach Zeitplan" | "Schiff erstellen: Neu".
10. Wählen Sie Scan-Typ: Sphäroid. Wählen Sie die gewünschten Kanäle aus: Phase + Hellfeld (um das Wachstum der Sphäroide zu verfolgen), Grün (um dem Tumorsignal zu folgen, Aufnahmezeit 300 ms) und Rot (um die Apoptose zu verfolgen, Aufnahmezeit 400 ms).
    1. Wählen Sie die gewünschte Vergrößerung: 10x.
    2. Wählen Sie das Plattenmodell und seine Position in der Schublade aus. Wählen Sie die Position der Vertiefungen aus, die abgebildet werden sollen. Geben Sie die Beschreibung des Experiments ein: Name, Typ der Zellen, Anzahl der Zellen.
11. Wählen Sie für die Analyseeinrichtung die Option Analyse auf später verschieben aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Zeitleiste und wählen Sie die Option Ausgewähltes Scangruppenintervall festlegenund stellen Sie Scans hinzufügen alle auf 4 Stunden und Insgesamt auf 24 Stunden ein. Die gewünschte Startzeit (mindestens 1 Stunde nach der Inkubation in der automatischen Bildgebungsapparatur) ist einzustellen.
12. Überprüfen Sie alle 2 Tage das Wachstum von Sphäroiden, indem Sie sich in die Bildgebungssoftware einloggen.
    1. Wählen Sie die Option Letzte Scans anzeigen und doppelklicken Sie auf das gewünschte Experiment. Wählen Sie im Bedienfeld "Bildkanäle" die Option "Hellfeld" und verwenden Sie dann das Werkzeug "Bildfunktionen messen", um den Durchmesser der Sphäroide zu messen. Es dauert 6 Tage, bis ein Sphäroid die gewünschte Größe erreicht hat: 0,5 mm Durchmesser. Fügen Sie an Tag 4 50 μl vollständiges RPMI-Medium pro Vertiefung hinzu, um den Verdampfungseffekt des Mediums zu begrenzen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Losnummer: RNBG7037
75 cm² Wachstumsfläche Kolben	VWR	430639	Losnummer: 2218002
75 cm² Wachstumsfläche Kolben	VWR	Tel.: 734-2705	Losnummer: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Losnummer: SLBTO777
RPMI 1640 med L-Glutamin, 10 x 500 mL	Lebenstechnologie (Gibco)	Artikel-Nr.: 21875-091	Losnummer: 1926384
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	Losnummer: 1904924A
Trypanblaue Lösung, 0,4%	Thermo Fischer	15250061	Losnummer: 1886513
96 Well-Platte, runder Boden	VWR	Nr. 734-1797	Losnummer: 33117036
X-VIVO 15 mit Gentamicin L-Gln, Phenolrot, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Losnummer: 8MB036
Reagenz-Reservoir	VWR	Tel.: 89094-672	Losnummer: 89094-672
15 mL Röhrchen	VWR	Nr. 734-1867	Losnummer: 19317044
Fötales Rinderserum	Gibco	10500064	Losnummer: 08Q3066K
HCT 116 kolorektale Karzinomlinie	ATCC	CCL-247	-
Incucyte S3	Essen Biowissenschaften