Drosophila Balzkonditionierung: Eine Methode zum Testen von Lernen und Gedächtnis bei Fliegen

Published: April 30, 2023
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Abstract

Quelle: Koemans, T. S., et al. Drosophila Balzkonditionierung als Maß für Lernen und Gedächtnis. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video beschreibt einen klassischen Konditionierungstest, der das Lernen und das Gedächtnis in Drosophila testet, die sogenannte Balzkonditionierung. Der Assay basiert auf der Verringerung der männlichen Balz nach einer Abstoßung durch ein nicht empfängliches präpaariges Weibchen. Das Beispielprotokoll zeigt einen Aufbau für das Verfahren, mit dem das Kurz- und Langzeitgedächtnis bewertet werden kann.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Koemans et al., Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp. (2017).

HINWEIS: In dem unten beschriebenen Protokoll wird eine Wiederholung von Sammlung, Training und Testen beschrieben. Um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu testen, sollten diese Schritte parallel, an mehreren Tagen und mit getrennten Fliegengruppen wiederholt werden (Tabelle 1). Das Protokoll basiert auf einem 10-tägigen Lebenszyklus vom Ei bis zum erwachsenen Tier, was normal ist, wenn Fliegen unter konstanten Bedingungen von 25 °C, 70 % Luftfeuchtigkeit und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus aufgezogen werden. Alle Aspekte dieses Protokolls gehen davon aus, dass die Bedingungen während des gesamten Assays konstant gehalten werden. Die Zeiten werden als Stunden vor dem Einschalten des Lichts (BLO) oder nach dem Einschalten des Lichts (ALO) im Inkubator angegeben, da dies je nach bevorzugter Tageszeit des Forschers bequem eingestellt werden kann. Verwenden Sie CO2 -Gas nur für die Erstsammlung naiver männlicher Fliegen und für die Sammlung von vorverpaarten Weibchen. Dieses Protokoll für die Konditionierung der Balz besteht aus den folgenden Schritten:

  1. Etablierung von präpaarten weiblichen Sammlungskulturen
  2. Etablierung von Kulturen für die Sammlung männlicher Probanden
  3. Vorbereitung von Wohnblöcken
  4. Etablierung von Paarungsfläschchen für die Herstellung von standardisierten vorverpaarten Weibchen
  5. Sammlung männlicher Probanden
  6. Ausbildung
  7. Testen
  8. Videodatenanalyse und Statistik

1. Etablierung von präverpaarten weiblichen Sammlungskulturen

  1. Powerfood zubereiten. 0,8 % (w/v) Agar, 8 % (w/v) Hefe, 2 % (w/v) Hefeextrakt, 2 % (w/v) Pepton, 3 % (w/v) Saccharose, 6 % (w/v) Glukose, 0,05 % (w/v) MgSO4 und 0,05 % (w/v) CaCl2 15 min lang in Wasser kochen. Lassen Sie die Lösung auf 70 °C abkühlen, bevor Sie 0,05 % (w/v) Methylparaben (ACHTUNG: giftig) und 0,5 % (v/v) Propionsäure (ACHTUNG: giftig) hinzufügen. Unter Rühren unter weiterem Abkühlen auf 50 °C gut mischen, um eine homogene Lösung zu erhalten.
  2. Bevor das Lebensmittel bei Raumtemperatur fest wird, geben Sie ~50 ml powerfood in jedes 175-ml-Plastikfläschchen. Lassen Sie die Speisen weiter abkühlen. Verschließen Sie das Fläschchen mit einem Stopfen.
    HINWEIS: Powerfood ist eine spezielle Futtermischung, die speziell für die Produktion einer großen Anzahl von Fliegen entwickelt wurde, vermutlich durch Induktion der Eiablage. Powerfood wird nicht zur Produktion männlicher Fliegen verwendet, die für die Verhaltensanalyse (Schritt 2) verwendet werden, da die atypische Ernährung und der mögliche Menschendrang die Entwicklung beeinflussen könnten.
  3. Am Tag -11 (Tabelle 1) beginnen Sie mit 5-20 Wildtyp-Kulturen mit ca. 60-100 Fliegen (eine Mischung aus Männchen und Weibchen) in Powerfood-Fläschchen; diese werden in Schritt 4 verwendet, um standardisierte vorverpaarte Weibchen zu produzieren. Fügen Sie jedem Fläschchen ein Filterpapier hinzu, um die Fläche zu vergrößern, auf der sich die Larven verpuppen können. Dadurch erhöht sich die Anzahl der Fliegen, die sich einschließen können.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 1.1-1.3 während des gesamten Versuchs regelmäßig, um genügend neu einschließende Fliegen als Input für die “Etablierung von Paarungsfläschchen für die Produktion standardisierter vorverpaarter Weibchen” (Schritt 4) zu erhalten.

2. Etablierung von Kulturen für die Sammlung männlicher Probanden

  1. Bereiten Sie normale Lebensmittel zu, die aus 0,5 % (w/v) Agar, 2,75 % (w/v) Hefe, 5,2 % (w/v) Maismehl, 11 % (w/v) Zucker, 0,05 % (w/v) Methylparaben und 0,5 % (v/v) Propionsäure in Wasser hergestellt werden, wie in den Schritten 1.1 und 1.2 beschrieben. Verschließen Sie die 175-ml-Kunststofffläschchen mit einem Fliegenfläschchenstopfen.
  2. Am Tag -10 (Tabelle 1) etwa 10-20 männliche Tiere mit etwa 30-75 jungfräulichen weiblichen Tieren (Material-/Ausrüstungstabelle) in jedes 175-ml-Fläschchen mit normalem Futter geben. Fügen Sie ein Filterpapier hinzu, um die Oberfläche für die Verpuppung zu vergrößern und die Produktivität zu maximieren.
  3. Stellen Sie drei bis sechs 175-ml-Fläschchen pro Genotyp her, um die erforderliche Anzahl männlicher Testpersonen zu erhalten.
    HINWEIS: Je nach Produktivität des gewünschten Genotyps können weitere Fläschchen erforderlich sein.

3. Vorbereitung von Wohnblöcken (Abbildung 2A)

  1. Schmelzen Sie ca. 50 mL powerfood pro Gehäuseblock in der Mikrowelle oder bereiten Sie es frisch zu.
  2. Geben Sie 500 μl powerfood mit einer Multidispenser-Pipette in jede Vertiefung eines 96-Well-Blocks mit flachem Boden.
  3. Lassen Sie die Lebensmittel bei Raumtemperatur fest werden.
  4. Decken Sie die Blöcke mit PCR-Klebefolie ab und bohren Sie mit einer Nadel mindestens 4 Löcher pro Vertiefung, um die Fliegen mit frischer Luft zu versorgen.
  5. Um jede Vertiefung öffnen zu können, schneidest du die Klebefolie mit einer Rasierklinge zwischen den einzelnen Reihen längs durch. Lassen Sie die Folie an einem Ende des Blocks intakt.
  6. Die Blöcke können bis zu 2 Tage bei 4 °C gelagert werden.
    HINWEIS: Lassen Sie die Blöcke vor der Verwendung wieder auf Raumtemperatur ausgleichen.

4. Einrichtung von Paarungsfläschchen für die Produktion standardisierter vorverpaarter Weibchen

  1. Am Tag -1 werden alle adulten Wildtyp-Fliegen aus vorverpaarten weiblichen Sammelkulturen bei 2-5 h BLO entfernt und entsorgt.
  2. Sammeln Sie Fliegen mit dem Aspirator (Abbildung 2B) aus diesen Fläschchen in Abständen von 2 bis 3 h (z. B. bei 30 min, 2,5 h und 5 h ALO) und legen Sie sie in ein neues Powerfood-Fläschchen, das mit einer kleinen Menge Hefepaste und Filterpapier ergänzt wird.
  3. Um ein Gedränge zu vermeiden und eine optimale Paarungsatmosphäre zu fördern, sollten Sie nicht mehr als 150-200 Fliegen in jedes neue Fläschchen übertragen. Stellen Sie sicher, dass alle Weibchen paaren, indem Sie mindestens 25 % Männchen zur Verfügung stellen. Stellen Sie sicher, dass genügend Weibchen in den Paarungsfläschchen vorhanden sind, um die Größe des Versuchs aufzunehmen.
    HINWEIS: Da dies ein entscheidender Schritt im Protokoll ist, stellen Sie sicher, dass nur frisch eingeschlossene Fliegen und keine alten Fliegen, Larven oder Puppen in das neue Paarungsfläschchen übertragen werden.
  4. Inkubieren Sie diese “Paarungsfläschchen” vier Tage lang, damit alle Weibchen genügend Zeit haben, sich zu paaren.

5. Sammlung männlicher Probanden

  1. Verwenden Sie an Tag 1 (Tabelle 1) bei 2-3 h BLOCO 2, um alle erwachsenen Fliegen aus den männlichen Sammelfläschchen zu entfernen (Schritt 2), aber lassen Sie in den nächsten Stunden mehr Fliegen einschließen.
  2. In den nächsten 5-6 Stunden alle 20-30 min neu eingeschlossene Fliegen mit CO2 entfernen und jedes Männchen mit dem Aspirator (Abbildung 2 B) in eine einzelne Vertiefung des Haltungsblocks (Schritt 3) setzen.
  3. Verschließen Sie die Vertiefung wieder mit der selbstklebenden PCR-Folie.
    HINWEIS: Dies ist ein entscheidender Schritt im Protokoll. Die Männchen sollten häufig eingesammelt werden. Gesammelte Männchen sollten in der Nähe des Zeitpunkts der Eklosion im Haltungsblock isoliert werden, wenn sie eine blasse Pigmentierung und das Vorhandensein von Mekonium im durchscheinenden Abdomen aufweisen.
    HINWEIS: Die schonende Verwendung des Aspirators ermöglicht den Transfer von Fliegen; Bei unsachgemäßer Anwendung werden die Fliegen jedoch gestresst, was zu Abweichungen im Assay führt (siehe Diskussion).
  4. Ziel ist es, bis zu 48 Männchen pro Genotyp zu sammeln. Dies führt zu einer geringen Überschreitung der maximalen Anzahl von Männchen, die für die Analyse sowohl naiver als auch trainierter Zustände benötigt wird, was zu einem gewissen Verlust bei späteren Transferschritten führt.

6. Schulung

  1. Die Fliegen mit CO2 aus dem Paarungsfläschchen (Schritt 4.2) nehmen und die vorverpaarten Weibchen von den Männchen trennen.
  2. Fügen Sie mit dem Aspirator ein einzelnes anästhesiertes, vorverpaartes Weibchen zu jeder Vertiefung in einer Reihe eines neuen Haltungsblocks hinzu.
  3. Mit dem Aspirator und ohne Anästhesie wird ein einzelnes naives Männchen aus dem in Schritt 5.2 aufgestellten Haltungsblock in die Vertiefung mit einem vorverpaarten Weibchen überführt. Nachdem der Rüde in die Vertiefung gelegt wurde, sofort wieder mit der Klebefolie verschließen; Lassen Sie das Männchen nicht entkommen.
    HINWEIS: Übertragen Sie männliche Fliegen vom Sauger in den Stallblock, indem sie ihr natürliches “negatives Geotaxi”-Verhalten ausnutzen.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 6.2-6.3, bis genügend Männchen-Weibchen-Paare gebildet sind. Im Idealfall etablieren Sie 24 Paare, zwei volle Reihen eines Haltungsblocks, pro Genotyp. Lassen Sie die restlichen naiven Rüden in dem ursprünglichen Haltungsblock, der in Schritt 5.2 aufgestellt wurde.
  5. Lassen Sie die Männchen-Weibchen-Paare während der Trainingszeit ungestört (Tabelle 2, Abbildung 1B).
    HINWEIS: Während dieser Zeit wird das Männchen um das Männchen werben und von dem verpaarten Weibchen verstoßen. Für Learning und STM beträgt die Trainingsdauer 1 h und für LTM 7-9 h.
  6. Beenden Sie das Training (Tabelle 2, Abbildung 1B), indem Sie einen Aspirator verwenden, um das Männchen vorsichtig vom vorverheirateten Weibchen zu trennen; verwenden Sie keine Anästhesie. Setzen Sie den abgetrennten Stecker in einen neuen Haltungsblock ein.
  7. Mit dem Sauger werden alle naiven Rüden sanft und ohne Betäubung aus dem in Schritt 5.2 aufgestellten Wohnblock in einen neuen Wohnblock überführt.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist für STM und Lernen optional, aber für LTM ist er sehr wichtig, da die Fliegen für zusätzliche 24 Stunden untergebracht werden, um LTM zu testen.
  8. Bei STM und LTM lassen Sie die Männchen 1 h bzw. ~24 h ruhen (Tabelle 2, Abbildung 1B), bevor Sie testen (Schritt 7).
  9. Zum Lernen testen Sie sofort die trainierten und naiven Männchen (Schritt 7).

7. Testen

  1. Fliegen aus Paarungsfläschchen (Schritt 4.2) mit CO2 einfangen und die vorverpaarten Weibchen von den Männchen trennen.
  2. Lassen Sie die Weibchen sich mindestens 1 h lang in einem Fläschchen mit normaler Nahrung von der Narkose erholen.
  3. Montieren Sie die Videorekorder im Voraus (Abbildung 2C), um alle Geräte vor Beginn der Tests bereit zu haben.
  4. Beginnen Sie den Test gemäß den unterschiedlichen Zeitplänen für Lernen, STM und LTM (Tabelle 2, Abbildung 1B). Führen Sie die Tests unmittelbar nach dem Training für das Lernen, 1 Stunde nach dem Training für STM und 24 Stunden nach dem Training für LTM durch.
  5. Mit dem Aspirator wird ein einzelnes Männchen vorsichtig aus dem ruhenden Wohnblock oder aus dem Trainingswohnblock, wenn das Lernen getestet wird (Schritt 6.7, trainiert; Schritt 6.8, naiv), in eine Hälfte einer Balzarena mit geschlossener Trennwand versetzt (Abbildung 2D; siehe Datei S1 für einen Bauplan).
    HINWEIS: Die Anwendung des natürlichen Verhaltens der “negativen Geotaxis” sollte ausreichen, um die männlichen Fliegen vom Aspirator in die Balzarena zu übertragen.
  6. Verschiebe das Einflugloch schnell, aber vorsichtig zur nächsten Arena und wiederhole Schritt 7.5, bis in allen 18 Arenen ein Männchen vorhanden ist.
  7. Mit dem Aspirator und ohne CO2 -Gehalt wird in der anderen Hälfte aller 18 Arenen ein vorverpaartes Weibchen (gesammelt in Schritt 7.2) hinzugefügt.
  8. Platzieren Sie die Balzkammer vorsichtig unter der Kamera, wobei die Öffnung der Vertiefungen nach unten zeigt (Abbildung 2C).
  9. Entfernen Sie die Trennwand der Arenen, um eine direkte Interaktion zwischen den Männchen und den vorverpaarten Weibchen zu ermöglichen.
  10. Beginnen Sie sofort mit der Aufzeichnung des Verhaltens für mindestens 10 Min.
    HINWEIS: Bei Verwendung eines Setups mit zwei Kameras kann die parallele Aufnahme von zwei Balzplatten in überlappenden Zeiträumen erfolgen, um die Effizienz zu maximieren.
  11. Leeren Sie die Balzarenen mit einem Handstaubsauger und lassen Sie die Balzkammer vor der Wiederverwendung lüften.
  12. Wiederholen Sie die Schritte 7.4-7.11, bis die Tests aller Genotypen und Erkrankungen (d. h. naiv und trainiert) abgeschlossen sind.

8. Analyse von Videodaten und Statistiken

  1. Berechnen Sie den Balzindex (CI), definiert als der Prozentsatz der Zeit, die das Männchen während der ersten 10 Minuten des Testzeitraums für jede einzelne männliche Fliege umwirbt.
    HINWEIS: Dies kann manuell durch Beobachtung des stereotypen Balzverhaltens (Abbildung 1A) oder durch den Einsatz von Computersoftware zur automatisierten Quantifizierung des Balzverhaltens erfolgen.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, 40-60 Männer pro Zustand über einen Zeitraum von drei Tagen zu analysieren, um eine ausreichende statistische Aussagekraft zu erreichen und die Konsistenz der CI-Daten zu beurteilen.
  2. Berechnen Sie den Lernindex (LI), definiert als die prozentuale Reduktion des mittleren KI von trainierten Männern im Vergleich zu naiven Männern (LI = (CInaiv – CItrainiert) / CInaiv). Werten Sie den LI für jeden Testtag aus und vergleichen Sie ihn mit dem kumulativen LI, der aus allen Testtagen zusammen berechnet wurde.
  3. Erstellen Sie eine separate zweispaltige Registerkarten-Datendatei mit “Genotype” und “CI” als Überschriften.
    HINWEIS: Bei diesen Überschriften wird zwischen Groß- und Kleinschreibung unterschieden. Der Name des Genotyps für jedes CI muss aus einer Beschreibung des Genotyps gefolgt von einem Unterstrich und der Trainingsbedingung bestehen (z. B. genotype_N und genotype_LTM usw., wobei N = naiv und LTM = Langzeitgedächtnis ist; siehe Ergänzungsdatei S2 für ein Beispiel). Diese Annotation ist wichtig, da die Funktion analearn trainierte und naive Fliegen anhand der Zeichen identifiziert, die nach dem ersten Unterstrich in der Spalte “Genotyp” vorhanden sind.
  4. Verwenden Sie das analearn R-Skript (Supplemental File S3), um einen Randomisierungstest durchzuführen, um die statistische Signifikanz von Unterschieden zwischen den LI-Werten verschiedener Genotypen zu beurteilen.
    1. Stellen Sie das Skript (Supplemental File S3) in R bereit, das eine Funktion namens “analearn” definiert
      HINWEIS: Die Funktionsdefinition lautet: analearn <- function(nboot = 10.000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
    2. Starten Sie die Funktion, indem Sie “analearn()” in die R-Befehlszeile eingeben und über das Pop-up-Fenster die zu analysierende Datendatei auswählen (erzeugt in Schritt 8.3).
    3. Wählen Sie die Referenzmutation aus, bei der es sich um den Kontrollgenotyp handelt, indem Sie die entsprechende Nummer eingeben und die Eingabetaste drücken.
      HINWEIS: Nach der Auswahl des Referenzgenotyps benötigt das Skript mehrere Sekunden, um 10.000 Bootstrap-Replikationen durchzuführen.
    4. Beachten Sie die Ausgabetabelle (Tabelle 3), die den Genotyp, die Lernbedingung (d. h. Lernen, STM oder LTM), das mittlere CI naiv, das mittlere CI trainiert, LI, die Differenz zwischen dem LI der Kontrolle und der experimentellen Bedingung (LI dif), die untere Grenze (LL) und die obere Grenze (UL) des 95%-Konfidenzintervalls des LI dif enthält, und der p-Wert, der die Wahrscheinlichkeit angibt, dass es keinen signifikanten Unterschied gibt.
      HINWEIS: analearn speichert eine Ausgabetextdatei in dem Verzeichnis, in dem sich die Datendatei befindet. Die Ausgabetabelle wird jedoch auch in der R-Studio-Konsole angezeigt. Der Standardname wird basierend auf dem Namen der bereitgestellten Datendatei erstellt.
    5. Es gibt mehrere Argumente in der analearn-Funktion, die verwendet werden können, um die Standardeinstellungen der Funktion zu ändern, um die Parameter des Bootstrappings anzupassen.
      HINWEIS: “nboot” definiert die Anzahl der Bootstrap-Replikate und ist standardmäßig auf 10.000 eingestellt. Dieser Wert kann in eine beliebige Ganzzahl größer als Null geändert werden. Tabelle 5 enthält mehrere Argumente, die verwendet werden können, um die Standardeinstellungen der Funktion zu ändern. Es wird jedoch nicht empfohlen, Daten zu verwenden, die mit einer geringen Anzahl von Bootstrap-Replikaten erstellt wurden.

Representative Results

Materials

<em>P{KK101437}VIE-260B</em>VDRC101437Dhat-at-RNAi in 60100 background
<em>P{KK108109}VIE-260B</em>Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
<em>w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)</em>panneuronal driver line
Containers for plant tissue cultureVWR960177175 mL plastic vials
Folded filtersWhatman10311643Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)Qiagen19579Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive FilmApplied Biosystems4306311PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor bladeAny sharp will do
Needle0.8 mm diameter
AspiratorCut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambersfile S1 can be opened with indicated CAD software
CamcorderSonycamera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
<strong>Name</strong><strong>Company</strong><strong>Catalog Number</strong><strong>Comments</strong>
power food
AgarSigmaA7002
YeastBruggeman
Yeast extractMP biomedicals0210330391
PeptoneSigmaP6838
SucroseSigmaS9378
GlucoseSigmaG7021
MgSO4SigmaM2643
CaCl2Merck1023780500
Methylparabene (CAUTION)SigmaH5501
Propionic acid (CAUTION)SigmaP1386
Demineralized water
Yeast pasteyeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
NameCompanyCatalog NumberComments
normal food
AgarMP biomedicals215017890
Yeastbruggeman
Corn flourde Molen
Sugarde Molen
Methylparabene (CAUTION)SigmaH5501
Propionic acid (CAUTION)SigmaP1386
Demineralized water
Drosophila Courtship Conditioning: A Method to Test Learning and Memory In Flies

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Cite This Article
Drosophila Courtship Conditioning: A Method to Test Learning and Memory In Flies. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20068, doi: (2023).

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