Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Qiang et al., A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae, J. Vis. Exp. (2018).
>1. Vorbereitung der Larven
- Zwei oder mehr Tage vor Beginn des Assays Kreuzungen der gewünschten Versuchs- und Kontrollkombinationen (mindestens 20 Weibchen und jeweils 10 Männchen) in Eiablageschalen wie von Wieschaus und Nüsslein-Volhard beschrieben, jedoch unter Verwendung von 50-ml-Polypropylenbechern und 6,0 cm Einweg-Petrischale, die Traubenagar enthalten und kurz vor der Verwendung mit Hefepaste bestrichen werden. Bewahren Sie Fliegen in Eiablageschalen im Dunkeln bei Raumtemperatur auf, bis sie benötigt werden.
- Rezept für Trauben-Agar – kombinieren Sie 100 ml gefrorenes 100%iges Traubensaftkonzentrat, 350 mL deioinisiertes Wasser, 5 mL Gletscheressig und 13 g D. melanogaster-Agar in einem 1-Liter-Glasbecherglas. In 1-2 Minuten in der Mikrowelle erhitzen und zwischen den Stößen umrühren, bis sich das Agar aufgelöst hat. Kühlen Sie die Lösung einige Minuten lang ab und fügen Sie dann 10 ml 10 % (w/v) Nipagen (Methyl-p-hydroxybenzoat) in 95 % Ethanol hinzu. Mischen, dann 7 mL pro Platte in 6,0 cm Einweg-Petrischalen pipettieren, gelieren lassen und 3-4 h bei Raumtemperatur trocknen lassen. Bei 4 °C in Plastiktüten lagern.
- Rezept für Hefepaste – 7 g Trockenhefe, 10 ml entionisiertes Wasser, mit einem Spatel zu einer gleichmäßigen Konsistenz verrühren.
- Zeitgesteuerte Eizellentnahme zur Erzeugung von Versuchs- und Kontrolllarven. Mit neuen, mit Hefe bestrichenen Traubentellern die Eier bei Raumtemperatur 4 Stunden lang in der Dunkelheit in den Morgenstunden sammeln. Entfernen Sie diese 4 h Auffangplatten und ersetzen Sie sie durch frische Teller. Inkubieren Sie die 4-stündigen Auffangplatten über Nacht bei 25 °C bis zum Nachmittag des nächsten Tages, wenn die meisten Larven geschlüpft sind. Sammle diese ersten Larven im Stadium und verwende sie, um das Experiment vorzubereiten.
>2. Einrichten von Assay-Platten
- Vorbereitung von Assay-Platten. Bereiten Sie für einen einzigen Durchlauf des Assays jeweils fünf Assay-Platten mit 10 Versuchslarven und fünf Platten mit 10 Kontrolllarven vor. Verwenden Sie einen 1,5 cm langen Korkbohrer, um einen zentralen Kern aus Agar von jeder Platte zu entfernen, um ein Loch für das Essen zu schaffen. Gib Hefepaste (0,8 - 0,9 g) in das Loch und tupfe sie vorsichtig mit einem Spatel ab, sodass ein Hügel entsteht, der das Loch ausfüllt.
- Zubereitung der Agarplatte – 700 mL deionisiertes Wasser mit 16 g D. melanogaster Agar in einem 2L Becherglas mischen und 5 Min. in der Mikrowelle erhitzen. Aus der Mikrowelle nehmen und mit einem Glasstab umrühren, um den ungelösten Agar in die Lösung zu bringen. 17,5 ml 10 % (w/v) Nipagen in 95 % Ethanol hinzufügen, mischen, dann die Mikrowellenerwärmung in 30 s Stößen fortsetzen und anschließend umrühren, bis sich der gesamte Agar vollständig aufgelöst hat. Ein oder zwei Minuten abkühlen lassen und dann 15 ml Aliquots in 10 cm große Petrischalen aus Kunststoff pipettieren. Agar gelieren lassen, Teller mit Deckel abdecken und einige Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur trocknen lassen. Teller in verschlossenen Plastiktüten bei 18 °C lagern.
HINWEIS 1: Um die Bildung von Nipagen-Kristallen auf der Oberfläche der Platten aufgrund übermäßiger Austrocknung zu vermeiden, verwenden Sie die Platten innerhalb weniger Tage nach der Zubereitung. Bei Bedarf können Kristalle wieder aufgelöst werden, indem man einige Mikroliter 95%igen Alkohol auf sie tropft.
HINWEIS 2: Chargen von Agar können unterschiedliche Geliereigenschaften haben. Die trockenen Gelplatten sollten sich fest anfühlen und ausreichend belastbar sein, dass ein sauberer, intakter Agarkreis entfernt werden kann, wenn der Korkbohrer zur Herstellung des Speiselochs verwendet wird (siehe oben).
- Einbringen von Larven in Testplatten. Wenden Sie mechanischen Druck an, um die Spitze eines Kunststoff-Mikroskopspatels zu krümmen, und tauchen Sie die Spitze in Hefepaste, um "Klebstoff" für die Aufnahme der Larven zu erhalten. Nehmen Sie die ersten Larven des Stadiums einzeln auf und legen Sie sie auf die Agarplatte in der Nähe des Futterhügels. Bereiten Sie mindestens fünf Replikationsplatten mit 10 Larven sowohl für Versuchs- als auch für Kontrollgenotypen vor. Sobald Sie fertig sind, verschließen und beschriften Sie jede Platte und stellen Sie die Platten (mit dem Deckel nach oben) an einem dunklen Ort bei Raumtemperatur (in unserem Labor beträgt diese 22 °C).
>3. Überwachung von Assay-Platten
- Untersuchen Sie die Teller täglich unter einem Präpariermikroskop und notieren Sie die Anzahl der Larven auf dem Futter oder auf der Agaroberfläche. Achten Sie auf sichtbare tote oder sterbende Larven. Beachten Sie, wann und ob ein Tunneln in das Agarsubstrat zu beobachten ist, wenn die Larven in das dritte Stadium vordringen. Notiere das Datum, an dem sich die Puppen zu bilden beginnen, und notiere alle Puppenanomalien. Setzen Sie die täglichen Beobachtungen fort, bis alle Larven abgestorben oder verpuppt sind.
- Die Puppen vorsichtig mit einer gebogenen Nadel vom Teller nehmen und auf eine Traubenplatte legen. Falls gewünscht, setzen Sie die Überwachung der Puppen fort, um festzustellen, wie viele als Erwachsene in der Nähe sind.
