Drosophila Grave og tunneling Assay: En metode til at vurdere væv hypoxi i Fly Larver

Overview

Denne video viser en metode til at teste hypoxi i Drosophila larver ved at vurdere deres gravende og tunneling evner. Ved hjælp af denne teknik kan forskere skelne larver, der oplever iltmangel, fra dem med udviklingsunderskud. Eksempelprotokollen demonstrerer opsætningen af denne analyse.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Qiang et al.,A Burrowing / Tunneling Assay til påvisning af hypoxi i Drosophila melanogaster Larver, J. Vis. Exp. (2018).

1. Forberedelse af larver

1. To eller flere dage før analysen påbegyndes, oprettes krydsninger af de ønskede forsøgs- og kontrolkombinationer (mindst 20 hunner og 10 hanner hver) i æglægningsretter som beskrevet af Wieschaus og Nusslein-Volhard, men ved hjælp af 50 mL polypropylenbægere og 6,0 cm engangs petriskåle indeholdende drue agar og smurt med gærpasta lige før brug. Hold fluer i æg-lægge retter i mørke ved stuetemperatur indtil det er nødvendigt.
2. Drue agar opskrift - kombinere 100 ml frosset 100% druesaft koncentrat, 350 ml deioiniseret vand, 5 ml glacial eddikesyre og 13 g D. melanogaster agar i et 1L glasbæger. Mikrobølgeovn i 1-2 min brister under omrøring mellem brister, indtil agar er alle opløst. Opløsningen afkøles i et par minutter, og tilsæt derefter 10 ml 10% (w/v) Nipagen (methyl-p-hydroxybenzoat) i 95% ethanol. Bland, derefter pipette 7 mL per plade i engangstændere 6,0 cm Petri retter, lad gel og tørre ved stuetemperatur i 3-4 timer. Opbevares ved 4 °C i plastikposer.
3. Gær pasta opskrift – 7 g tørret gær, 10 mL deioniseret vand, blandes med en spatel indtil ensartet konsistens.
4. Tidsinddelte ægsamlinger til at generere eksperimentelle og kontrollere larver. Ved hjælp af nye, gær-smurt, drue plader, indsamle æg ved stuetemperatur i 4 timer i mørke i morgentimerne. Fjern disse 4 timers opsamlingsplader og udskift med friske plader. Inkuber de 4 timers opsamlingsplader natten over ved 25 °C indtil om eftermiddagen den næste dag, hvor de fleste larver vil være udklækket. Saml disse første instar larver og bruge dem til at oprette eksperimentet.

2. Opsætning af analyseplader

1. Fremstilling af analyseplader. For en enkelt kørsel af analysen, forberede fem assay plader hver af 10 eksperimentelle larver og fem plader af 10 kontrol larver. Brug en 1,5 cm korkborer til at fjerne en central kerne af agar fra hver plade, hvilket skaber et hul til maden. Sæt gærpasta (0,8 - 0,9 g) i hullet og klap forsigtigt med en spatel for at lave en høj, der fylder hullet.
2. Agar plade forberedelse – kombinere 700 mL deioniseret vand med 16 g D. melanogaster agar i en 2L glasbæger og mikrobølgeovn i 5 min. Fjern fra mikrobølgeovnen og rør med en glasstang for at bringe uopløst agar ind i opløsningen. Tilsæt 17,5 mL på 10% (w/ v) Nipagen i 95% ethanol, bland, og fortsæt derefter mikrobølgeopvarmning i 30 s brister efterfulgt af omrøring, indtil al agar er helt opløst. Afkøl i et minut eller to, derefter pipette 15 mL aliquots i 10 cm plast Petri retter. Lad agar gel, dække plader med låg og lad dem tørre ved stuetemperatur i et par timer eller natten over. Opbevar plader i forseglede plastikposer ved 18 °C.
   NOTE 1: For at undgå dannelse af Nipagen krystaller på overfladen af pladerne på grund af overskydende udtørring, skal du bruge plader inden for få dage efter forberedelsen. Om nødvendigt kan krystaller opløses igen ved at tabe et par mikroliter på 95% alkohol på dem.
   NOTE 2: Partier af agar kan have forskellige geleringsegenskaber. De tørre gelplader skal være faste at røre ved og tilstrækkeligt modstandsdygtige til, at en ren, intakt cirkel af agar kan fjernes, når du bruger korkboreren til at skabe madhullet (se ovenfor).
3. Opsætning af larver i analyseplader. Brug mekanisk tryk til at kurve spidsen af en plastik mikrospatula og dyppe spidsen i gær pasta til at give "lim" for at afhente larver. Hent først instar larver individuelt og læg dem på agarpladen tæt på madhøjen. Forbered mindst fem replikatplader på 10 larver til både eksperimentelle og kontrolgenotyper. Når pladen er færdig, skal du lægge låg på og mærke den og sætte pladerne (lågsiden op) i et mørkt rum ved stuetemperatur (i vores laboratorium er dette 22 °C).

3. Overvågning af assayplader

1. Undersøg plader dagligt under et dissekerende mikroskop og registrere antallet af larver på toppen af fødevaren eller ud på agaroverfladen. Bemærk eventuelle synlige døde eller døende larver. Bemærk, hvornår og hvis tunneling i agar substratum ses som larver flytte ind i tredje instar. Bemærk datoer, hvor pupper begynder at danne og notere eventuelle pupal abnormiteter. Fortsæt daglige observationer, indtil alle larver er døde eller poppede.
2. Fjern pupper forsigtigt fra pladen med en bøjet drillepind og overfør til en drueplade. Hvis det ønskes, fortsætte med at overvåge pupper til at bestemme, hvor mange eclose som voksne.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Dehydrated yeast
Frozen grape juice concentrate	Welch's		Available at most large supermarkets
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
Drosophila agar	Apex Bioresearch Products	66-103
Methyl-para-hydroxybenzoate	Apex Bioresearch Products	20-658
EQUIPMENT
50 ml polypropylene beakers
6.0 cm disposable Petri dishes	Falcon	08757100B
10 cm disposable plastic Petri dishes	E+K Scientific	EK-24104
Plastic microspatulas	Corning Incorporated	3012
Bent teasing needle	Nasco	S08848MH
Dissecting microscope			Any microscope with 10-30X magnification