Drosophila Dissektion der Imaginalscheibe der Larva: Eine Methode zur Beobachtung der Entwicklung von Epithelien

Zusammenfassung

Quelle: Morimoto, K. und Tamori, Y. Induktion und Diagnose von Tumoren bei Drosophila Imaginal Disc Epithelien. J. Vis. Exp. (2017).

Bei der Färbung von Drosophila-Imaginalscheiben wird oft eine grobe Dissektion durchgeführt, bei der die Scheiben freigelegt werden, aber am Körper haften. Nach dem Färben werden die interessierenden Discs isoliert und montiert. Das Beispielprotokoll demonstriert ein Verfahren zum Disparieren und Montieren von Flügel-Imaginalscheiben.

Protokoll

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Morimoto und Tamori, Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia, J. Vis. Exp. (2017).

>1. Zerlegung von Larven

1. Sammeln Sie wandernde Larven des dritten Stadiums mit einem Holzstab oder einer stumpfen Pinzette, genotypisieren Sie sie mit geeigneten Fluoreszenzmarkern (z. B. EGFP) unter einem stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop und legen Sie sie in eine Sezierschale mit PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung).
2. Waschen Sie die Larven in PBS, indem Sie sie mit 2-ml-Kunststoffpipetten pipettieren.
3. Mit einer Pinzette die Mitte der Larve einklemmen und mit der anderen Pinzette den Körper in zwei Hälften reißen.
4. Mit einer Pinzette den Mundhaken der vorderen Hälfte einklemmen und mit der anderen Pinzette den Mund in Richtung Körper schieben, um den Körper auf links zu drehen.
5. Entfernen Sie unnötige Materialien wie Speicheldrüsen oder Fettkörper mit einer Pinzette.

>2. Fixierung und Antikörperfärbung

1. Übertragen Sie die präparierte vordere Hälfte des Larvenkörpers (einschließlich der imaginalen Flügelscheiben) in ein 1,5 mL Kunststoffröhrchen und fixieren Sie 10 min lang 1 mL Fix-Lösung (4% Formaldehyd in PBS) bei Raumtemperatur im Dunkeln mit sanfter Rotation.
   Vorsicht: Formaldehyd ist giftig und hat krebserregendes Potenzial. Tragen Sie Schutzhandschuhe und -kleidung, um Hautkontakt zu vermeiden.
   HINWEIS: In diesem Teil finden alle Schritte auf einem Nährstoffator bei Raumtemperatur im Dunkeln statt, sofern nicht anders angegeben.
2. Entfernen Sie die Fix-Lösung, und verwerfen Sie sie. Waschen Sie das Taschentuch dreimal für jeweils 15 Minuten mit 1 ml PBT (0,3 % Triton X-100 in PBS).
3. Entfernen Sie das PBT und fügen Sie 1 ml PBTG (0,2 % Rinderserumalbumin und 5 % normales Ziegenserum in PBT) zur Blockierung hinzu und nutieren Sie 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C.
4. PBTG wird entfernt und die Primärantikörperlösung, die entsprechend mit PBTG verdünnt ist (siehe Materialtabelle), zugegeben und über Nacht bei 4 °C nutatiert.
5. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie das Gewebe dreimal für jeweils 15 Minuten mit 1 mL PBT.
6. PBT wird entfernt und eine Sekundärantikörperlösung zugegeben, die entsprechend mit PBTG (1:400) verdünnt ist. 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C nutatieren.
7. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung und waschen Sie das Gewebe zweimal für jeweils 15 Minuten mit 1 mL PBT.
8. Um F-Aktin zu färben, entfernen Sie PBT und fügen Sie Phalloidinlösung hinzu, die entsprechend in PBS (1:40) verdünnt ist. Dann 20 min nutatieren. Entfernen Sie die Phalloidinlösung und waschen Sie das Gewebe zweimal für jeweils 15 Minuten mit 1 ml PBT.
9. Um die nukleäre DNA gegenzufärben, entfernen Sie PBT und fügen Sie DAPI-Lösung (4', 6-Diamidino-2-phenylindol) (0,5 μg/ml DAPI in PBS) hinzu. Dann 10 Min.
   Vorsicht: DAPI hat krebserzeugendes Potenzial. Tragen Sie Schutzhandschuhe und -kleidung, um Hautkontakt zu vermeiden.
10. Entfernen Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie das Gewebe zweimal für jeweils 15 Minuten mit 1 ml PBT.
11. Spülen Sie es einmal 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 1 ml PBS.
12. PBS wird entfernt und 500 μl 100 % Glycerin als Voreinbettmedium zugegeben.

>3. Montage auf Objektträgern

1. Legen Sie das gefärbte Gewebe mit einer 2-ml-Kunststoff-Transferpipette auf einen Objektträger.
2. Übertragen Sie das Gewebe mit einer Pinzette auf Tropfen Eindeckmedium auf einen anderen Objektträger.
3. Halten Sie mit einer Pinzette das Ende des präparierten Gewebes nach unten und ziehen Sie mit der anderen Pinzette die Antennenscheiben des Gehirns und des Auges weg.
   HINWEIS: Bewahren Sie die präparierten Gehirne auf, um sie in der Nähe der Flügel-Imaginalscheiben zu platzieren. Das Gehirn fungiert als Plattform, die verhindert, dass das Deckglas die Flügel-Imaginalscheiben zerquetscht.
4. Um die Flügel-Imaginalscheiben zu isolieren, halten Sie das Ende des präparierten Gewebes mit einer Pinzette fest, kratzen Sie vorsichtig an der Körperwand und reißen Sie die Scheiben mit der anderen Pinzette ab.
   HINWEIS: Wenn es schwierig ist, Flügel-Imaginalscheiben zu finden, schälen Sie die Luftröhre von der hinteren zur vorderen Seite. Flügel-Imaginalscheiben haften an der Luftröhre.
5. Die imaginalen Scheiben vorsichtig mit einem Deckglas abdecken und mit Nagellack versiegeln; bei 4 °C lagern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
reagenzien
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Wako	Nr. 162-19321
TritonX-100	Wako	Nr. 168-11805
Formaldehyd	Wako	Tel.: 064-00406
Serumalbumin für Rinder	Sigma	Nr. A7906
Normales Ziegenserum	Sigma	Nr. G6767
Eindeckmedium, Vectashield	Vector Laboratorien	H-1000
DAPI	Sigma	Nr. D9542
Maus-Anti-Dlg 4F3	Entwicklungsstudien Hybridom-Bank	4F3 Anti-Discs groß, RRID:AB_528203	in PBTG verdünnen, 1:40
Anti-MMP1 für Maus	Entwicklungsstudien Hybridom-Bank	3A6B4, RRID:AB_579780	3 gemischt 1:1:1 und verdünnt in PBTG, 1:40
Anti-MMP1 für Maus	Entwicklungsstudien Hybridom-Bank	3B8D12, RRID:AB_579781	3 gemischt 1:1:1 und verdünnt in PBTG, 1:40
Anti-MMP1 für Maus	Entwicklungsstudien Hybridom-Bank	5H7B11, RRID:AB_579779	3 gemischt 1:1:1 und verdünnt in PBTG, 1:40
Anti-Atubulin für Maus	Entwicklungsstudien Hybridom-Bank	AA4.3, RRID:AB_579793	verdünnt in PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Molekulare Sonden	Nr. A22283	in PBS verdünnen, 1:40
Anti-Maus-IgG-Antikörper für Ziegen, Alexa Fluor 546	Molekulare Sonden	Nr. A11030	verdünnt in PBTG, 1:400
Fliegen-Stämme
sd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#8609	rekombiniert mit UAS-EGFP
upd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#26796	rekombiniert mit UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi	Wiener Drosophila RNAi-Zentrum	#51247
UAS-scrib-RNAi	Wiener Drosophila RNAi-Zentrum	#105412
UAS-RasV12	Bloomington Drosophila Stock Center	#64196
Fachhochschule Yki3SA	Bloomington Drosophila Stock Center	#28817
hsFLP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6
Act>CD2>GAL4 (ausklappbares GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	#4780	rekombiniert mit UAS-EGFP
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#5428	X-chromosom
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6658	drittes Chromosom
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24650	zweites Chromosom
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24651	drittes Chromosom
vkg-GFP	Morin et al. 2001		GFP-Proteinfalle