Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Immarigeon et al., A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands, J. Vis. Exp. (2019).
1. Lösungen und Materialaufbereitung
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor.
- Prepare Serum Supplemented Medium (SSM): Schneider's Drosophila Medium ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin.
- Aliquots von 1x Trypsin-Enzym (z. B. TrypLE Express Enzym) vorbereiten und bei Raumtemperatur lagern.
- Zubereitung von Papain-Aliquoten [50 U/ml] (bei -20 °C gelagert und nur einmal aufgetaut).
- 1x Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS, bei Raumtemperatur lagern) herstellen.
- Bereiten Sie mehrere flammenabgerundete Pipettenspitzen für die physikalische Dissoziation der akzessorischen Drüsen vor.
HINWEIS: Verwenden Sie für den Umgang mit Zubehördrüsen Spitzen mit geringer Retention, da diese dazu neigen, an unbehandeltem Kunststoff zu haften. Durch den Prozess der Flammenverrundung wird die Öffnung der Spitze verkleinert und die Kanten der Spitze geglättet. Dies gewährleistet eine effiziente Dissoziation nach dem Peptidaseverdau, ohne die Zellmembranen zu scheren.
- Schneiden Sie mit einer scharfen Klinge eine 200-μl-Spitze ab und führen Sie sie vorsichtig über eine Flamme, um die Spitze abzurunden, so dass die Öffnung für die Handhabung in Schritt 2.7 breiter, aber glatt ist.
- Verengen Sie die Öffnung mehrerer 1.000-μl-Spitzen, indem Sie die Spitzenöffnung weniger als eine Sekunde lang in der Nähe einer Flamme führen. Drehen Sie die Spitze leicht, um ein Überschmelzen oder Verstopfen zu vermeiden. Sortieren Sie die Spitzen von schmaler bis breiter. Dies kann durch Timing der Aspirationsgeschwindigkeit erreicht werden. Versuchen Sie, eine kleine Stichprobe von AGs zu dissoziieren, um die Wirksamkeit der engsten Spitzen zu testen.
HINWEIS: Diese Spitzen sind entscheidend für mechanisches Rühren. Hochwertige, flammenabgerundete Pipettenspitzen ermöglichen eine vollständige Dissoziation bei gleichzeitiger Erhaltung der Zellviabilität. Daher werden diese Spitzen am Ende des Vorgangs zur Wiederverwendung gründlich mit Wasser gewaschen. Dies ermöglicht eine tagtäglich reproduzierbare Dissoziation.
2. Dissektion der akzessorischen Drüsen
- Legen Sie 20 bis 25 männliche Drosophila in eine Glasschale auf Eis.
- Präparieren Sie 1 Männchen in SSM. Entfernen Sie den Fortpflanzungstrakt und befreien Sie das akzessorische Drüsenpaar von allen anderen Geweben mit Ausnahme des Ejakulationsgangs.
HINWEIS: Entfernen Sie Hoden, da die freigesetzten Spermien Klumpen bilden und den Dissoziationsprozess stören können. Entfernen Sie den Ejakulationskolben, was die Handhabung erschwert, wenn er schwimmt.
- Übertragen Sie die Zubehördrüsen mit einer Pinzette auf eine Glasplatte, die bei Raumtemperatur mit SSM gefüllt ist. Wiederholen Sie die Schritte 2.2-2.3 20 Mal, um eine Charge von 20 Drüsenpaaren in SSM.
zu erhalten.
HINWEIS: Diese Schritte werden in 15 bis 20 Minuten erreicht. AGs sollten gesund aussehen und die peristaltischen Bewegungen der Muskelschicht um die Drüsen herum sollten sichtbar sein. GFP kann mit einem Fluoreszenzmikroskop überwacht werden.
- Übertragen Sie die Zubehördrüsen für eine 1-2-minütige Wäsche bei Raumtemperatur auf 1x PBS.
HINWEIS: Für eine bessere Dissoziation ist es zwingend erforderlich, die Drüsen mit PBS zu spülen. Die Dauer dieses Schritts sollte jedoch begrenzt sein, da die Zellen Anzeichen von Stress bei PBS zeigen; dissoziierte Sekundärzellen in PBS schwellen schnell an und sterben ab.
- Verdünnen Sie 20 μl Papain [50 U/ml] in 180 μl 1x Trypsin-Enzym, um die Dissoziationslösung zu erhalten (zum Hoch- oder Herunterskalieren halten Sie 9 μl Trypsin-Enzym und 1 μl Papain für jeden Mann). Übertragen Sie mit einer Pinzette die Zubehördrüsen auf diese Lösung.
- Isolieren Sie die Spitze der akzessorischen Drüsen (mit Sekundärzellen) vom proximalen Teil. Drücken Sie mit einer feinen Pinzette die Mitte eines Drüsenlappens fest zusammen und schneiden Sie mit der scharfen Spitze einer zweiten Pinzette. Entfernen Sie den proximalen Teil der akzessorischen Drüsen und den Ejakulationsgang, um die Dissoziation zu verbessern und die Zellsortierzeit zu verkürzen.
HINWEIS: Das Präparieren des distalen Teils von 20 Drüsenpaaren dauert 15 bis 20 Minuten und die Verdauung durch Peptidasen beginnt somit bei Raumtemperatur.
- Nachdem alle Drüsenspitzen präpariert wurden, überführen Sie sie mit einer speziellen 200-μl-Pipettenspitze, die in Schritt 1.2.1 hergestellt wurde, in ein 1,5-ml-Röhrchen. Er sollte breit, abgerundet und nass sein, bevor er mit den Drüsen angefasst wird.
HINWEIS: Zum Pipettieren von akzessorischem Drüsengewebe sollten die Spitzen immer mit einer geeigneten Lösung (Trypsin-Enzym oder SSM, bewahren Sie zu diesem Zweck jeweils ein Röhrchen auf) vorbefeuchtet werden. Spülen Sie die Spitzen zwischen den Proben vorsichtig aus, um eine Kontamination zu vermeiden.