Drosophila melanogaster Ovarialdissektion: Eine Technik zur ex vivo Gewebepräparation

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Parker, D. J., et al. Untersuchung der mitochondrialen Struktur und Funktion in Drosophila-Eierstöcken. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video beschreibt die allgemeine Anatomie des Drosophila-Eierstocks und zeigt eine Methode zum Präparieren von Eierstöcken für Live- oder fixierte Bildgebung.

Protokoll

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Parker et al., Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries, J. Vis. Exp. (2017).

1. Vorbereitung von Drosophila (die benötigten Werkzeuge sind in Abbildung 1A)

dargestellt

Für jeden der beschriebenen Versuche ist Drosophila (bei Raumtemperatur oder 25 °C gehalten) innerhalb von 5 Tagen nach der Eklosion zu sammeln und in ein Fläschchen zu geben, das mit 5 - 7 ml Drosophila-Futter gefüllt ist (siehe Materialtabelle), mit nicht mehr als 25 Fliegen in jedem Fläschchen; halten Sie ein Verhältnis von Weibchen zu Männchen von 2:1 ein.
Streuen Sie eine kleine Menge granulierte Hefe darüber, um die Eiproduktion von Drosophila anzuregen. Führen Sie die experimentelle Manipulation innerhalb von 2 - 4 Tagen durch.

2. Dissektion von Drosophila-Eierstöcken (die benötigten Werkzeuge sind in Abbildung 1A)

dargestellt

Erwärmen Sie das Insektenpräpariermedium (siehe Materialtabelle) auf Raumtemperatur (25 °C). Füllen Sie drei Vertiefungen einer Glaspräparierschale mit acht Vertiefungen und 200 μl Medium in jeder Vertiefung.
Betäuben Sie Drosophila mit CO₂, indem Sie die Nadel der Blaspistole unter den Stopfen des Fläschchens halten. Lege sie auf ein Fliegenpad. Sortieren Sie mit einem Präpariermikroskop 5 Weibchen aus und legen Sie sie in die erste Vertiefung der Präparierschale. Behandeln Sie jeweils eine Drosophila, wenn Sie Live-Mikroskopie durchführen.
Während Sie durch das Okular des Dissektionsmikroskops schauen, trennen Sie den Thorax mit zwei Pinzettenpaaren vom Bauchraum. Übertragen Sie die Bäuche mit der Pinzette vorsichtig in die zweite Vertiefung der Schale.
Benutze eine Pinzette, um den Bauch am hinteren Ende zu halten, und schiebe die Eierstöcke (zusammen mit dem anderen Bauchinhalt) langsam mit der anderen Pinzette heraus. Sollte dieser Versuch fehlschlagen, entfernen Sie vorsichtig das abdominale Exoskelett, indem Sie die Pinzette in das vordere Ende einführen, um die Eierstöcke freizugeben.
Halten Sie mit der Pinzette einen einzelnen Eierstock am undurchsichtigen hinteren Ende (d. h. die mit Eigelb gefüllten Eier im Spätstadium) und bewegen Sie ihn vorsichtig in die dritte Vertiefung der Schale, um ihn zu necken, um ihn für die Lebendmikroskopie zu verarbeiten oder um ihn zu fixieren, um eine Immunfärbung durchzuführen.
Ziehen Sie die Schutzhülle vorsichtig um die Eierstöcke herum, indem Sie mit einer Nadel leicht vom hinteren zum vorderen Ende jedes Eierstocks führen, während Sie sie mit einer Pinzette am hinteren Ende halten.
HINWEIS: Um Schäden beim Teasern zu minimieren, biegen Sie die Nadelspitze und zoomen Sie auf jeden Eierstock, indem Sie die Vergrößerung des Mikroskops erhöhen (Abbildung 1A). Das Necken sollte effektiv genug sein, um die Hülle zu brechen, aber es sollte auch vorsichtig durchgeführt werden, um die Integrität der Eierstöcke zu erhalten.

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Ergebnisse

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Abbildung 1: Versuchsplan und Vorbereitung. (A) Werkzeuge, die bei den beschriebenen Verfahren verwendet werden: A. Fliegenfläschchen; B. Insekten-Präpariermedium, C. Paraformaldehyd; D. Fliegenbürste; E. Präparierschale; F. Deckglas; G. Mikrofuge-Röhrchen. H. Schale mit Glasboden; I. Objektträger; J. 1.000 μl Mikropipette; K. 200 μl Mikropipette; L. 2,5-μl-Mikropipette; M. Necknadel ...