Malpighische Tubuli-Dissektion von einer adulten Fliege: Isolierung eines osmoregulatorischen und ausscheidenden Organs

Zusammenfassung

Quelle: Rossano, A. J. und Romero, M. F. Optische Quantifizierung des intrazellulären pH-Werts in Drosophila melanogaster Malpighischen Tubulenepithelien mit einem fluoreszierenden genetisch kodierten pH-Indikator. J. Vis. Exp. (2017).

Dieser Artikel beschreibt die Dissektion der vorderen Malpighischen Tubuli (MT) von einer weiblichen Drosophila-Fliege und ein Beispielprotokoll von Rossano et al. (2017), in dem die MTs für die Live-Bildgebung in einer Perfusionskammer vorbereitet werden.

Protokoll

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Rossano und Romero, Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genecounterly-encoded pH Indicator, J. Vis. Exp. (2017).

1. Vorbereitung von Poly-L-Lysin-Objektträgern

1. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben PAP-Stift einen Rand von 40 x 20 mm um die Oberseite von Standard-Dias im Format 75 x 25 mm und legen Sie sie 15 Minuten lang bei RT trocknen. Verwenden Sie große Deckgläser, wenn die Objektträger nicht mit Bildoptiken kompatibel sind.
2. 2 ml 0,01%ige Poly-L-Lysin (PLL)-Lösung auf jeden Objektträger geben und 1 Stunde bei RT beiseite stellen.
3. Entfernen Sie überschüssiges PLL mit einer Pipette. Bewahren Sie die Lösung in einem konischen 50-ml-Fläschchen für die zukünftige Verwendung auf. Bei 4 °C lagern.
4. Die restliche Lösung wird mit einer Vakuumleitung abgesaugt. Führen Sie die Vakuumleitung über die gesamte Objektträgerfläche, um sicherzustellen, dass keine Lösung auf den Objektträgern verbleibt.
5. Legen Sie die Objektträger vor der Verwendung für 1 weitere Stunde bei RT beiseite. Lagern Sie die Dias bis zu 1 Monat lang trocken bei RT in einem Standard-Diabuch.

2. Vorbereitung der Präparierschale und der Glasstäbe

1. 0,5 ml Elastomerhärter zu 4,5 ml Elastomerbasis in einer 35 x 10 mm großen Petrischale aus Polystyrol bei RT hinzufügen, um eine Tiefe von 5 mm zu erzeugen. Mit einer Einwegpipettenspitze mischen. Lassen Sie das Elastomer O/N bei RT.
   aushärten. HINWEIS: Elastomer sollte klar und blasenfrei sein. Das Entfernen von Blasen kann erleichtert werden, indem die Elastomerplatten nach dem Gießen 10 - 15 Minuten lang in einem Vakuumbehälter aufbewahrt werden.
2. Halten Sie einen Glasstab mit einem Durchmesser von 5 mm zwischen den Händen und schmelzen Sie die Mitte des Stabes über einem brennenden Bunsenbrenner, während Sie die Enden auseinander ziehen. Wenn das Glas schmilzt, zieht es schneller, um einen dünnen (0,1 mm) und konischen Schaft zu erzeugen (Abbildung 1).
   HINWEIS: Ein 45° Winkel am Schaft ist oft hilfreich bei der Handhabung von Tubuli. Dies kann erreicht werden, indem eine Hand abgesenkt wird, wenn der Schaft gezogen wird (siehe Abbildung 1).
3. Brechen Sie den dünnen Schaft in der Mitte mit der stumpfen Seite einer einschneidigen Rasierklinge aus Kohlenstoffstahl. Überprüfen Sie das dünne Ende des Stabes unter einem Präparierzielfernrohr, um sicherzustellen, dass der Bruch sauber ist.

3. Dissektion von adulten Drosophila anterioren Malpighischen Tubuli

1. Sammeln Sie die Sezierschale und den gezogenen Glasstab aus Sektion 2, einen PLL-beschichteten Objektträger aus Sektion 1, einen selbstklebenden Perfusionsgrubenteiler, Vakuumfett, einen 4 x 2" großen Streifen Siegelfolie, 2 Paar #5 feine Pinzetten und 40 mL Aliquots eiskaltes Schneider's Medium und RT iPBS.
2. Verteilen Sie Vakuumfett auf das Dichtband und drücken Sie den selbstklebenden Perfusionsgrubenteiler auf das Band, um den Boden mit Fett zu bestreichen. Ziehen Sie den selbstklebenden Trenner für die Perfusionsvertiefung ab und legen Sie ihn mit der Fettseite nach unten auf einen PLL-beschichteten Objektträger. Entfernen Sie den Perfusions-Well-Teiler, um einzelne Proben-Wells in hydrophobem Fett zu hinterlassen.
3. Geben Sie 200 μl RT iPBS in die mit Fett umschlossene Vertiefung auf dem PLL-beschichteten Objektträger und schieben Sie den Objektträger unter das Stereoskop.
4. UAS-pHerry/capaR-GAL4 Fliegen in ein leeres Fliegenfläschchen geben und 10 Min. auf Eis betäuben
   HINWEIS: Diese Methode der Anästhesie sorgt im Gegensatz zu CO₂ dafür, dass die Fliegen nicht dehydrieren.
5. Gießen Sie eiskaltes Schneider-Medium in die Präparierschale und übertragen Sie mit einer feinen Pinzette eine einzelne betäubte weibliche Fliege unter einem Präparierstereoskop in die Schale.
6. Halten Sie die Fliege mit einer Pinzette am Brustkorb fest und greifen Sie mit der anderen sanft den hinteren Teil des Bauches. Ziehe den hinteren Teil der Fliege mit der Pinzette in kurzen, bewussten Bewegungen auf. Sobald der Hinterdarm sichtbar ist, greifen Sie das distale Ende und befreien Sie den Darm und die MTs von den darunter liegenden Tracheolen, indem Sie den Hinterdarm durch wiederholte, kurze Züge vom Körper wegziehen.
   HINWEIS: Die vorderen und hinteren MTs sind dort sichtbar, wo sie durch den Harnleiter auf die Verbindung von Mitteldarm und Hinterdarm treffen. Das erste Paar von MTs, das frei ist, werden wahrscheinlich die hinteren Tubuli sein, da sie den Hinterdarm umgeben. Diese können ignoriert werden (Abbildung 2A).
7. Kneifen Sie die vorderen MTs am Harnleiter mit einer feinen Pinzette ab, sobald der zweite Satz MTs aus dem Abdomen befreit ist. Dadurch werden die vorderen MTs vom Darm getrennt und der Harnleiter geschlossen.
8. Nehmen Sie die freien vorderen MTs mit dem gezogenen Glasstab auf, indem Sie den Stab so unter den Harnleiter schieben, dass die Tubuli zu beiden Seiten fallen. Heben Sie die MTs gerade nach oben aus der Lösung.
9. Drehen Sie den Glasstab so, dass die MTs und der Harnleiter an der Unterseite des Stabes haften und senken Sie den Harnleiter gerade nach unten auf den Objektträger ab. Befestigen Sie den Ureter und versiegeln Sie die distalen Enden der MTs, indem Sie den Ureter nach unten auf den Glasschieber drücken (Abbildung 2B). Manipulieren Sie die MTs nicht mehr als nötig. Die MTs sollten in der Lösung nach oben schwimmen, wobei der Harnleiter am Objektträger verankert ist.
10. Streichen Sie mit dem feinen Ende des Glasstabes vorsichtig über jeden Tubulus über die Objektträgeroberfläche. Stützen Sie den Stab gegen den Objektträger, um ein Zerquetschen des Tubulus zu vermeiden, und schieben Sie den Stab über die Oberseite des Tubulus, indem Sie ihn distal nach proximal bewegen, um die gesamte Länge jedes Tubulus an der Oberfläche des PLL-beschichteten Objektträgers zu befestigen (Abbildung 2C).
11. Setzen Sie den selbstklebenden Perfusionsvertiefungsteiler wieder auf den Objektträger, um eine kleine, mit Flüssigkeit gefüllte Vertiefung über dem montierten Tubulus zu bilden.
12. Legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch. Positionieren Sie die Zu- und Abflusskapillaren über der Ein- bzw. Auslassöffnung der Perfusionsvertiefung.
    HINWEIS: Der Vertiefungsteiler kann weggelassen werden, wenn eine offene Perfusionskammer gewünscht wird. In diesem Fall können die Zu- und Abflusskapillaren auf gegenüberliegende Seiten einer Bildgebungsvertiefung ausgerichtet werden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Herstellung von Glasstäben für die Handhabung von Malpighischen Tubuli.
A - E. Prozess des Erhitzens und Ziehens eines Glasstabes, um eine Verjüngung und einen Winkel zu erzeugen, die für die Handhabung von MTs geeignet sind. Pfeile ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Poly-L-Lysin (PLL)-Lösung	Sigma-Aldrich	Nr. P4832	Bei 4 °C lagern, wiederverwendbar.
Selbstklebende Perfusionskammerabdeckungen, Klebegröße 1 mm, Kammerdurchmesser × Dicke 9 mm × 0,9 mm, Anschlussdurchmesser 1,5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Kann bei Bedarf ausgetauscht werden, um es an das Perfusionssystem anzupassen.
Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Kit	Ellsworth Klebstoffe	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Erhältlich von mehreren Anbietern.
Helfende Hände Lötständer	Hafenfracht-Werkzeuge	Artikel-Nr.: 60501	Erhältlich von mehreren Anbietern.
Schneiders Medium	Fisher Scientific	21720024	Bei 4 °C in sterilen Aliquoten lagern.
#5 Pinzetten aus Inox-Stahl	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11252-20	Kann je nach Komfort des Experimentators ausgetauscht werden.
Petrischale aus Polystyrol 35 x 10 mm	Corning Biowissenschaften	Fisher Scientific 08-757-100A	Die genaue Marke und Größe sind unwichtig.
75 x 25 mm Objektträger	Corning Biowissenschaften	Artikel-Nr.: 2949-75X25	Die genaue Marke und Größe kann variieren, solange die Perfusionsvertiefungen kompatibel sind.
Filimentiertes Borosilikat-Kapillarglas, ID 1,5 mm, AD 0,86 mm, Dicke 0,32 mm	Warner Instruments	Tel.: 64-0796	Filiment nicht erforderlich, Glas kann ersetzt werden, um Perfusionsschläuche und Perfusionsvertiefungen zu ergänzen.
Vakuum-Silikonfett	Sigma-Aldrich	Z273554	Erhältlich von mehreren Anbietern.
Glasstäbe, 5 mm Durchmesser	delphiglass.com	9198	Die genaue Größe ist die persönliche Vorliebe, mehrere Anbieter verfügbar
PAP Hydrophober Stift	Sigma-Aldrich	Z377821	Erhältlich von mehreren Anbietern.
Siegelfolie	Sigma-Aldrich	Nr. P7668	Erhältlich von mehreren Anbietern.
15 mL Falcon Röhrchen	BD Falke	352096	Erhältlich von mehreren Anbietern.
50 mL Falcon Röhrchen	BD Falke	Artikel-Nr.: 352070	Erhältlich von mehreren Anbietern.
Präparieren des Stereoskops	Zeiss	Entdeckung.V8	Jedes Präparierstereoskop kann verwendet werden.
UAS-pHerry transgene Drosophila melagnogaster	Erhältlich bei Romero Lab		Erstveröffentlichung: Rossano et al., 2017
capaR-GAL4 Treiberlinie Drosophila melagnogaster	Erhältlich bei Romero Lab		Erstveröffentlichung: Terhzaz et al., 2012
c724-GAL4 Treiberlinie Drosophila melagnogaster	Erhältlich bei Romero Lab		Erstveröffentlichung: Sozen et al., 1997
Einschneidige Rasierklinge aus Kohlenstoffstahl	Elektronenmikroskopie	Artikel-Nr.: 71960	Erhältlich von mehreren Anbietern.
Mikroskopie-Objektträger-Ordner	Fisher Scientific	16.-04	Erhältlich von mehreren Anbietern.
Bunsenbrenner	Fisher Scientific	Tel.: 50-110-1231	Erhältlich von mehreren Anbietern.
Polystrene Drosophila Aufzuchtfläschchen mit Flügeln	Genesee Scientific	32-109BF	Vergleichbare Artikel können ersetzt werden.
2,5 L Labor-Eiskübel	Fisher Scientific	Tel.: 07-210-129	Erhältlich von mehreren Anbietern.
200 μl Barriere-Pipettenspitzen	MidSci	AV200	Erhältlich von mehreren Anbietern.
200 μl Pipette mit variablem Volumen	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Erhältlich von mehreren Anbietern.

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