Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Eidhof et al., High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay, J. Vis. Exp. (2017).
1. Aufbau der Island Assay Box
- Bereiten Sie eine Schale aus einem robusten Material wie Polymethylmethacrylat (PMMA) vor, um eine Wasserschicht (z. B. ein Bad) aufzunehmen. Stellen Sie sicher, dass das Material nicht weiß ist.
HINWEIS: Es werden Abmessungen von 40 x 35 x 2,5 cm3 empfohlen (Abbildung 1A).
- Bereiten Sie eine Box (42 x 38 x 25 cm3) aus einem robusten, transparenten Material, wie z. B. PMMA, vor, die um die Badewanne herum aufgestellt wird, um zu verhindern, dass die Fliegen in den Laborraum entweichen. Platzieren Sie an der Seitenseite ein Loch (20 x 30 cm2), das groß genug ist, damit der Versuchsleiter die Fläschchen leicht mit Fliegen anfassen kann, und lassen Sie sie auf die Insel fallen (Abbildung 1A).
- Bereiten Sie eine erhöhte Plattform mit den Abmessungen 10 x 15 x 2,5 cm3 vor, die aus einem undurchlässigen Material (PMMA oder Kunststoff) besteht, das wasserdicht ist.
HINWEIS: Diese Plattform muss eine gleichmäßige weiße Oberfläche haben, um einen guten Kontrast für die Bildanalyse zu gewährleisten. Die Größe ist nicht unbedingt festgelegt, aber sie sollte groß genug sein, um sicherzustellen, dass alle Fliegen zunächst auf der Plattform landen und die Chance haben, darauf zu laufen (Abbildung 1A).
- Befestigen Sie die Plattform, indem Sie sie entweder in die Badewanne kleben oder Gewichte oder andere schwere Gegenstände in die Plattformbox legen, um Positionsänderungen der Plattform während der Experimentier-/Filmsitzung zu verhindern.
2. Softwareanforderungen und Installation
- Installation einer Bildaufzeichnungssoftware.
- Laden Sie eine Bildaufzeichnungssoftware herunter, um die Inselbildserie aufzuzeichnen (siehe Materialtabelle) und installieren Sie die Software auf einem Computer.
HINWEIS: Die in diesem Protokoll beschriebene Bildgebungs- und Aufzeichnungssoftware wird nur von Windows unterstützt. Eine Alternative für andere Benutzer wurde in die Materialtabelle aufgenommen.
3. Vorbereitung der Fliegen, die im Island Assay getestet werden sollen
- Sammeln Sie inszenierte Fliegen für jede Versuchsbedingung unter Kälte- oder Kohlendioxid (CO 2)-Anästhesie, wie zuvor beschrieben (über einen Zeitraum von 1 - 2 Tagen).
- Bereiten Sie mindestens 3 Probenfläschchen pro Versuchsbedingung vor, die jeweils etwa 15 inszenierte Fliegen enthalten. Verwenden Sie nur Fliegen mit intakten Flügeln, die ähnlichen Alters und Geschlechts haben.
HINWEIS: Für die hier beschriebenen Experimente wurden 5 Probenfläschchen mit 15 männlichen Fliegen der Genotypen w-; Actin-Gal4/+ (Steuerung) und w-; Aktin-Gal4/GD11950 (Tefu-RNAi) wurden am Tag der Eklosion entnommen, 4 Tage lang gealtert und zur Durchführung des Inselassays verwendet. RNAi, Kontrollstämme und der Actin-Gal4-Treiber wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle).
- Lassen Sie die Fliegen sich erholen, um Auswirkungen der Anästhetika zu vermeiden (mindestens 1 Tag bei Verwendung von CO2), bevor Sie die gesammelten Fliegen im Insel-Assay im interessierenden Alter testen.
4. Versuchsaufbau
HINWEIS: Siehe Abbildung 1B.
- Geben Sie kaltes Wasser mit etwas Seife in die Badewanne und positionieren Sie die Plattform in der Mitte.
HINWEIS: Die Seife verringert die Oberflächenspannung des Wassers; Fliegen, die das Wasser berühren, ertrinken. Dadurch wird verhindert, dass während des Fortschreitens der Versuchssitzung immer mehr Fliegen in der Box fliegen.
- Stellen Sie die Klarsichtbox auf das Tablett und beleuchten Sie die Plattform von oben mit einer Lampe.
HINWEIS: Die Beleuchtung der Plattform ist hauptsächlich erforderlich, um den richtigen Videokontrast zu gewährleisten. Hierfür eignet sich eine gewöhnliche 12-V-LED-Leuchte.
- Positionieren Sie die Webcam direkt über der Plattform (außerhalb der Box) und schließen Sie sie an einen Computer an.
- Erstellen Sie neue Ordner auf dem Computer, um die verschiedenen experimentellen Daten vor den Experimenten zu speichern.
- Befolgen Sie die Struktur des Beispiels, das in Abbildung 2A dargestellt ist, um die Ordner zu erstellen. Wenn der Versuchsplan beispielsweise das Testen von zwei Genotypen mit jeweils fünf Replikaten erfordert, erstellen Sie zunächst einen Hauptordner mit dem Datum des Experiments. Erstellen Sie im Hauptordner zwei Unterordner (einen pro Genotyp). Erstellen Sie in den Genotyp-Ordnern fünf neue Unterordner, einen pro replicate.
HINWEIS: Für die weitere Analyse ist es unerlässlich, dass die Bildserien, die den einzelnen Experimenten entsprechen, in Ordnern mit eindeutigen Namen gespeichert werden.
5. Einrichtung der Videoeinstellungen im Abschnitt "Aufnahmegerät" der Benutzeroberfläche
- Öffnen Sie die Bildaufzeichnungssoftware und klicken Sie unter dem Reiter "Capture" auf "Time-Lapse Images..." und wählen Sie die entsprechende Webcam als "Capture Device" aus.
- Platzieren Sie eine tote Fliege auf der Insel; passen Sie die Videoeinstellungen an, indem Sie auf das Feld "Videoeinstellungen" klicken. Scrollen Sie durch die Symbolleisten und passen Sie Helligkeit, Kontrast und Farbe so an, dass die tote Fliege schwarz auf weißem Hintergrund erscheint (Abbildung 2B). Wenn die Einstellungen abgeschlossen sind, klicken Sie auf "OK".
6. Einstellungen für Aufnahme und Videospeicherung im Abschnitt "Zeitraffer" der Benutzeroberfläche
- Passen Sie die Einstellungen im "Zeitraffer-Film-Setup" an, um das Experiment als .avi Datei zu speichern. Klicken Sie auf "Durchsuchen...", wählen Sie das Verzeichnis aus, in dem der Film gespeichert werden soll, legen Sie den Namen des Videos fest und drücken Sie auf "Speichern".
HINWEIS: Die Videodatei wird nicht für die Quantifizierung von Daten verwendet; Es kann jedoch nützlich sein, sich einen Überblick über das Experiment zu verschaffen.
- Passen Sie die Einstellungen im Abschnitt "Zeitraffer-Film-Setup" an.
- Wählen Sie im Komprimierungsfeld "Intel IYUV Code" für die Videokomprimierung und wählen Sie "Alle 0,1 Sekunden ein Bild aufnehmen", wobei die "Wiedergaberate (Bilder pro Sekunde):" bei 10 liegt.
- Speichern Sie die Zeitreihen des Experiments als .bmp Frames, indem Sie auf "Erweitert..." klicken. Wählen Sie "Für jedes aufgenommene Frame ein .bmp Bild erstellen". Klicken Sie auf "Durchsuchen". Wählen Sie im Fenster "Während der AVI-Filmaufnahme" dasselbe Verzeichnis aus (wie in Schritt 6.1 ausgewählt), klicken Sie auf "Öffnen" und drücken Sie "Ok".
HINWEIS: Beachten Sie, dass die Frames während des Experiments als .bmp Dateien gespeichert werden (für die Datenanalyse erforderlich). Das Programm benennt die Frames als "A", gefolgt von der Nummer, die der Frame-Aufnahmesequenz entspricht (z. B. "A_number.bmp") (Abbildung 2C). Speichern Sie die Bilder, die zu verschiedenen Experimenten gehören, immer in einem neuen Ordner, um sicherzustellen, dass zuvor aufgenommene Bildserien nicht überschrieben werden. Beachten Sie, dass die Bilder nicht automatisch im selben Ordner wie die Videodatei gespeichert werden, es sei denn, dieser Ordner wird unter "Durchsuchen..." ausgewählt, indem Sie auf das Feld "Erweitert" klicken.
7. Insel-Assay und Datenerfassung
- Drücken Sie die Starttaste in der Zeitraffer-Bildoberfläche der Bildaufnahmesoftware, um die Aufnahme zu starten.
- Klopfen Sie 2-3 Mal auf das Versuchsfläschchen mit den Fliegen (Schritt 3), um sicherzustellen, dass sich die Fliegen am Boden des Fläschchens befinden. Entfernen Sie schnell den Stopfen des Fläschchens und klopfen Sie mit einer kräftigen Bewegung auf das Fläschchen auf die Plattform, so dass alle Fliegen gleichzeitig auf die Plattform fallen (Abbildung 1C).
- Drücken Sie nach ca. 30 s die "Stop"-Taste, um die Aufnahme zu beenden.
HINWEIS: Verschwinden alle Fliegen von der Plattform, kann die Aufzeichnung früher gestoppt werden.
- Entfernen Sie die Fliegen, die nach dem Stoppen der Bildaufnahme 30 s auf der Plattform verbleiben, von Hand.
- Bevor Sie mit der Aufzeichnung des nächsten Experiments fortfahren, ändern Sie das Zielverzeichnis für die .bmp Dateien und Filme (siehe Abschnitt 6).
