Lebensdauerprotokoll für Drosophila melanogaster: Generierung von Überlebenskurven zur Identifizierung von Unterschieden in der Langlebigkeit von Fliegen

Zusammenfassung

Quelle: Bovier, T. F., et al. Methoden zum Testen der endokrinen Störung bei Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019).

Wissenschaftler verwenden das Drosophila-Lebensdauerprotokoll, um zu messen, wie verschiedene experimentelle Bedingungen die Langlebigkeit von Fliegen beeinflussen, und erstellen dabei Überlebenskurven, um die experimentellen Ergebnisse zu quantifizieren. Das Probenprotokoll zeigt, dass der Assay angewendet wird, um die Auswirkungen auf die Langlebigkeit zu untersuchen, die sich aus der Exposition gegenüber unterschiedlichen Konzentrationen von endokrinen Disruptorchemikalien (EDCs) wie 17-α-Ethinylestradiol (EE2) ergeben.

Protokoll

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Bovier et al., Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).

1. Zubereitung von Speisen

1. Verwenden Sie zur Bestandserhaltung und für das Larvenwachstum ein Maismehlmedium, das 3 % Hefepulver, 10 % Saccharose, 9 % vorgekochtes Maismehl und 0,4 % Agar enthält, danach Maismehlmedium (CM) genannt.
   1. 30 g Hefe in 100 mL Leitungswasser geben, zum Kochen bringen und 15 min kochen lassen.
   2. Separat 90 g vorgekochtes Maismehl, 100 g Zucker und 4 g Agar in 900 ml Leitungswasser gut mischen.
   3. Die Lösung zum Kochen bringen, die Hitze reduzieren und 5 Minuten unter ständigem Rühren kochen.
   4. Nach 5 Minuten die heiße Hefelösung dazugeben und weitere 15 min köcheln lassen.
   5. Schalten Sie die Wärmequelle aus und lassen Sie die Lösung auf ca. 60 °C abkühlen.
   6. 5 ml/l 10% Methyl-4-hydroxybenzoat in Ethanol geben, gründlich mischen und 10 Min. ruhen lassen
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig mit der Menge an Methyl-4-hydroxybenzoat, da eine hohe Konzentration an Fungizid für Larven tödlich sein kann.
   Geben
   7. Sie das Medium in Fläschchen/Flaschen ab: 8 mL in jedes Fliegenfläschchen (25 mm x 95 mm), 3 mL in jedes Fliegenfläschchen (22 mm x 63 mm) und 60 mL in jede Fliegenflasche (250 mL).
   8. Decken Sie die Fläschchen mit einem Käsetuch ab und lassen Sie sie vor der Lagerung 24 Stunden lang bei Raumtemperatur (RT) trocknen.
   9. Kalibrieren Sie experimentell die richtige Konsistenz und Hydratation des CM, indem Sie entweder die Menge des verwendeten Agars und/oder die Kühl-/Trocknungszeiten ändern.
      HINWEIS: Ungesteckte, verpackte und verpackte Fläschchen sind etwa 15 Tage lang bei 4 °C haltbar.
2. Für erwachsene Drosophila ist ein Medium mit 10 % Hefepulver, 10 % Saccharose und 2 % Agar zu verwenden, das im Folgenden als adultes Medium (AM) bezeichnet wird.
   1. Mischen Sie 10 g Hefepulver, 10 g Saccharose, 2 g Agar mit 100 ml destilliertem Wasser.
   2. Bringen Sie diese Mischung zweimal im Abstand von 3 Minuten zum Kochen oder bis sich der Agar aufgelöst hat, indem Sie eine Mikrowelle verwenden.
   3. Sobald die Lösung auf 60 °C abgekühlt ist, fügen Sie 5 ml/l 10 % Methyl-4-hydroxybenzoat in Ethanol hinzu, mischen Sie gründlich und geben Sie sie in Fläschchen (10 mL pro Fläschchen) ab.
   4. Decken Sie die Fläschchen mit einem Käsetuch ab und lassen Sie sie vor der Lagerung 24 h bei RT trocknen.
      HINWEIS: Ungesteckte, verpackte und verpackte Fläschchen sind etwa 15 Tage lang bei 4 °C haltbar.

2. Drosophila EDC Dosierung

1. Bereiten Sie eine geeignete Stammlösung vor, indem Sie das ausgewählte EDC in dem geeigneten Lösungsmittel auflösen. Für das EE2 (Molekulargewicht 296,403) werden 1,48 g in 10 ml 100%igem Ethanol zu einer 0,5 μm Stammlösung aufgelöst und bei -80 °C gelagert< > Vorsicht: EDCs gelten als Umweltschadstoffe und es sollten Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit ihnen getroffen werden.
2. Die EE2-Stammlösung wird in 10%igem Ethanol in Wasser (v/v) verdünnt, um eine 100 mM Lösung zu erhalten. Nehmen Sie die nächsten Verdünnungen (0,1 mM, 0,5 mM und 1 mM) in CM-Lebensmitteln vor, beginnend mit der niedrigsten Konzentration und unter Verwendung der gleichen Endkonzentration des Lösungsmittels für jede Behandlungsgruppe. Verwenden Sie für die Kontrollfläschchen das gleiche Volumen des Lösungsmittels allein.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, die Endkonzentration des Lösungsmittels so niedrig wie möglich zu halten, wobei zu beachten ist, dass die Endkonzentration von Ethanol 2% in Fliegenfutter nicht überschreiten sollte.
3. Die Lösung, die die richtige Verdünnung des ausgewählten EDC enthält, vor der Verfestigung zu den Lebensmitteln auf Maismehlbasis geben, gründlich mit einer Küchenmaschine mischen, 10 mL in Fläschchen geben, mit Baumwollgaze abdecken und vor der Verwendung 16 h bei RT trocknen lassen.
   HINWEIS: Verwenden Sie dieses Medium sofort nach seiner Vorbereitung.
4. Für die Aufzucht von adulten Tieren werden verschiedene Arbeitslösungen von EE2 (10 mM, 50 mM bzw. 100 mM) in 10 % Ethanol in Wasser (v/v) hergestellt und jeweils 100 μl auf die Oberfläche des AM aufgetragen, um die gewünschte Konzentration des EE2 (0,1 mM, 0,5 mM und 1 mM) zu erhalten. Verwenden Sie für die Kontrolle das gleiche Volumen des Lösungsmittels allein.
   HINWEIS: Alternativ können Sie die Lösung, die die richtige Verdünnung des ausgewählten EDC enthält, zu einer kleinen Menge AM in einem konischen 50-ml-Röhrchen hinzufügen, gründlich vortexen und 1 mL davon auf die Oberfläche der AM-Fläschchen schichten.
   1. Fläschchen mit Baumwollgaze abdecken, bei RT 12-16 h unter leichtem Rühren trocknen lassen und sofort verwenden.
      HINWEIS: Der Trocknungsprozess sollte experimentell angepasst werden, da er von der Umgebungsfeuchtigkeit abhängt.

3. Fliegen aufziehen

1. Verwenden Sie einen robusten isogenen Stamm wie Oregon R, der von mehreren Generationen im Labor gepflegt wird.
2. Halten Sie die Fliegen in einem befeuchteten, temperaturgesteuerten Inkubator mit natürlichem 12-Stunden-Licht: 12 Stunden dunkler Photoperiode bei 25 °C in Fläschchen mit CM-Futter.
3. Verwenden Sie in jedem Assay Fläschchen bei RT.

4. Lebensdauer-Protokoll

1. Stellen Sie 20 Fläschchen mit 8 Weibchen und 4 Männchen auf und halten Sie sie bei 25 °C in CM (je 10 mL).
2. Nach 4 Tagen entsorgen Sie die Fliegen und stellen Sie die Fläschchen wieder in den Inkubator.
   HINWEIS: Diese Fliegen können verwendet werden, um erneut zu starten, um andere alterssynchronisierte Kohorten der Fliegen zu erhalten.
3. Am späten Nachmittag des 9. Tages nehmen Sie alle neu eingeschlossenen Fliegen aus den Fläschchen und stellen Sie sie wieder in den Brutkasten ein.
   HINWEIS: Einige Erwachsene sollten bereits am neunten Tag mit dem Schließen beginnen; Das Wegwerfen dieser Fliegen ermöglicht es, eine maximale Anzahl synchronisierter Fliegen zu sammeln, wodurch die unachtsame Selektion von früh aufstrebenden Fliegen vermieden wird.
4. 16-24 Stunden später werden die erwachsenen Fliegen (1 Tag alt) beiderlei Geschlechts in vier Gruppen von 250 ml-Flaschen mit AM-Futter umgefüllt, das mit drei verschiedenen EDC-Konzentrationen und eine mit dem Lösungsmittel allein ergänzt wurde. Sammeln Sie bei Bedarf am nächsten Tag eine weitere Charge.
5. Halten Sie die Fliegen 2-3 Tage lang bei 25 °C, damit sie sich paaren können.
   HINWEIS: Der Tag der Übergabe an die AM-Lebensmittelfläschchen entspricht dem ersten Tag des Erwachsenenalters.
6. Nach zwei bis drei Tagen sortieren Sie jede Kohorte von Fliegen nach Geschlecht in zwei Gruppen unter leichter CO₂ -Betäubung. Unterteilen Sie jedes Geschlecht nach dem Zufallsprinzip in fünf Fläschchen pro Behandlung mit einer Dichte von 20 Individuen pro Fläschchen, bis drei Replikate von 5 parallelen Fläschchen für jedes Geschlecht und jede Behandlung vorhanden sind.
   HINWEIS: Arbeiten Sie mit kleinen Gruppen von Fliegen, um mögliche lang anhaltende Gesundheitsprobleme aufgrund der langen Einwirkung von CO₂ zu vermeiden.
7. Bereiten Sie eine Lebensdauertabelle vor, in der die Anzahl der toten Fliegen von der Anzahl der überlebenden Fliegen bis zur vorherigen Übertragung abgezogen wird, so dass bei jeder Übertragung automatisch die Anzahl der Überlebenden erhalten wird.
8. Fliegen alle 3 Tage zur gleichen Zeit in neue Fläschchen mit dem entsprechenden Futter umfüllen und auf Tod prüfen.
   HINWEIS: Der Transfer muss ohne Betäubung erfolgen, da dies einen langfristigen negativen Einfluss auf die Langlebigkeit der Fliege haben könnte.
   1. Notieren Sie bei jedem Transfer das Alter der Fliegen und die Anzahl der toten Fliegen.
      HINWEIS: Die Anzahl der überlebenden Fliegen wird automatisch in der Tabelle berechnet, aber es wird empfohlen, sie visuell zu überprüfen. Fliegen, die während des Transfers versehentlich entkommen oder sterben, sollten nicht in Betracht gezogen werden. Achten Sie darauf, dass Sie tote Fliegen, die zu dem neuen Fläschchen getragen werden, das diese Notiz in der Tabelle angibt, nicht zweimal zählen.
   2. Wiederholen Sie die Schritte 4.8 und 4.8.1, bis alle Fliegen abgestorben sind.
9. Erstellen Sie für jede Behandlungsgruppe eine Überlebenskurve, wie in Abbildung 1 gezeigt, um die Überlebenswahrscheinlichkeit einer Fliege zu einem bestimmten Zeitpunkt anzuzeigen.
10. Führen Sie drei unabhängige Experimente für jede Behandlungsgruppe von Fliegen durch, indem Sie für jedes Experiment 100 neu geschlossene Fliegen verwenden.
11. Erstellen Sie eine Tabelle, in der die mittlere Lebensdauer (durchschnittliche Überlebenstage aller Fliegen für jede Gruppe), die halbe Sterbezeit (Zeitraum in Tagen, der erforderlich ist, um eine Sterblichkeit von 50 % zu erreichen) und die maximale Lebensdauer (maximale Anzahl von Tagen, die benötigt werden, um eine Sterblichkeit von 90 % zu erreichen) angegeben werden.
12. Berechnen Sie die prozentualen Unterschiede zwischen den einzelnen Behandlungsgruppen in Bezug auf die Kontrollgruppe.
13. Führen Sie statistische Analysen durch, um die verschiedenen Behandlungsgruppen zu vergleichen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Lebensdauerkurven. Auf der linken Seite ist eine repräsentative Tabelle dargestellt, in der die Anzahl der toten Fliegen alle 3 Tage sowohl für die Behandlungsgruppe (Medium + EDC [0,05 mM EE2]) als auch für die Kontrollgruppe (Medium + Lösungsmittel) über den gesamten Versuchszeitraum erfasst wurde. Die mittlere Lebensdauer jeder Gruppe wurde mit der MATRIXSUMME berechnet. PRODUKT; Die b...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
17α-Ethinylestradiol	Sigma	Nr. E4876-1G
Agar für Drosophila medium	BIOSIGMA	789148
Maismehl	CA' BIANCA
Drosophila-Fläschchen	BIOSIGMA	789008	25 mm x 95 mm
Drosophila-Fläschchen	BIOSIGMA	789009	29 mm x 95 mm
Drosophila-Fläschchen	Kaltek	Nr. 187	22 mm x 63 mm
Ethanol	FLUKA	Nr. 2860
Glasflasche			250 mL Flaschen
Glasfläschchen	Mikrotechnik	ST 10024	Flachbodenrohr 100 x 24
Instant Success Hefe	ESKA		Hefepulver
Methyl4-hydroxybenzoat	Sigma	Nr. H5501
Stereomikroskop mit LED-Leuchten	Leica		S4E
Saccharose	HIMEDIA	MB025
Stabmixer Pimmy	Ariete		Küchenmaschine