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Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Castells-Nobau et al., Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology, J. Vis. Exp. (2017).
1. Anforderungen vor der Bildverarbeitung
- Führen Sie Drosophila-Open-Book-Präparationen von wandernden Larven (L3) im dritten Stadium durch, wie zuvor beschrieben.
- Co-immunolabelte Drosophila NMJ-Terminals unter Verwendung einer Kombination von zwei Markern: Dlg-1 oder Hrp zusammen mit Brp für die Analyse mit "Drosophila NMJ Morphometrics" und Syt oder Csp zusammen mit Brp für die Analyse mit "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
HINWEIS: Antikörper derselben Spezies können kombiniert werden, indem ein Antikörper mit einem Antikörper-Konjugationskit wie den Zenon Alexa Labeling Kits vormarkiert wird.
- Abbildung von NMJ-Terminals mit einem Mikroskop Ihrer Wahl, z. B. Fluoreszenz (mit oder ohne ApoTome) oder konfokale Mikroskopie.
- Erfassen Sie einen 2-Kanal-Bildstapel des NMJ-Anschlusses.
- Passen Sie die Mikroskopeinstellungen so an, dass Kanal 1 das mit Dlg-1 (oder Hrp, Syt, Csp) immunmarkierte NMJ-Terminal und Kanal 2 das mit Brp immunmarkierte NMJ-Terminal erfasst.
- Optional können Einkanalbilder (von Synapsen, die mit einem einzigen Antikörper immunmarkiert wurden) mit den Makros analysiert werden. Bild von NMJs, die speziell mit Dlg-1 oder Hrp für die Analyse mit "Drosophila NMJ Morphometrics" oder Syt oder Csp für "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" immunmarkiert sind.
HINWEIS: Es ist nicht möglich, Synapsen zu analysieren, die nur mit Anti-Brp immungefärbt sind.
- Exportieren Sie die erhaltenen Bilder als einzelne .tiff Dateien. Kehrt die Kanalreihenfolge vor dem Ausführen der Makros um, wenn sie nicht wie angegeben erfasst wurde.
2. Softwareanforderungen und Installation
- Laden Sie die Makros: "Drosophila NMJ Morphometrics" und "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" von der folgenden Website herunter: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
- Bewegen Sie den Cursor auf den Ordner "Makros Update 1" und klicken Sie auf die erscheinende Option "Ansicht". Eine Liste mit dem Inhalt dieses Ordners wird angezeigt. Der Ordner enthält die Makros "Drosophila NMJ Morphometrics" und "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
HINWEIS: Beide Makros sind kompatibel mit der Fidschi-Version 1.4, die ebenfalls im selben Ordner bereitgestellt wird. Die Makros können in neueren Versionen nicht ausgeführt werden. Bitte verwenden Sie die bereitgestellte Version 1.4. Es ist unproblematisch, diese Version zu starten, auch auf Rechnern, auf denen eine neuere Fidschi-Version verfügbar ist.
- Klicken Sie auf "Alle herunterladen". Der Inhalt des Ordners wird als .zip Datei auf den Computer heruntergeladen. Entpacken Sie die heruntergeladene Datei.
- Kopieren Sie die Dateien Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm und Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm in Fiji.app/plugins/ Verzeichnis. Wenn Sie das Programm neu starten, erscheinen die Makros am unteren Rand des Dropdown-Menüs Plugins.
3. Führen Sie das Untermakro "Convert to Stack" aus, um Z-Projektionen und Hyperstacks der NMJ-Bilder zu erstellen
- Starten Sie die grafische Oberfläche, indem Sie in der Symbolleiste Plugins auswählen und im Dropdown-Menü "Drosophila NMJ Morphometrics" auswählen.
- Definieren Sie die Einstellung "Unique File String" in der grafischen Oberfläche des Makros.
HINWEIS: Die Mikroskopsoftware verwendet eine Identifikationssignatur, um Ebenen und Kanäle zu organisieren, wenn Stapel als einzelne .tiff Dateien gespeichert werden. Die eingegebene eindeutige Dateizeichenfolgeneinstellung muss die Signatur angeben, die von der Software der ersten Ebene des ersten Kanals zugewiesen wurde (wichtig: die niedrigste Ebene und die Kanalnummer müssen angegeben werden).
- Wählen Sie nur das Untermakro "In Stapel konvertieren" aus, klicken Sie auf "OK" und wählen Sie den Ordner aus, in dem sich die Bilder befinden. Wenn ein Hauptverzeichnis mit mehreren Unterordnern ausgewählt wird, werden alle einzelnen '.tiff-Dateien innerhalb des Hauptverzeichnisses und des Unterordners verarbeitet, die den eindeutigen Kriterien für Dateizeichenfolgen entsprechen.
- Wenn der Z-Stack nur einen Kanal enthält, aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Nur Kanal 1".
- Beachten Sie, dass zwei neue Dateien pro NMJ-Bild angezeigt werden, die standardmäßig als stack_image_name und flatstack_image_name bezeichnet werden. Speichern Sie nur diese Stacks und Flatstacks für die weitere Analyse. Die .tiff Dateiserien können an dieser Stelle gelöscht werden, wodurch die benötigten Speicherkapazitäten minimiert und potenzielle Fehlerquellen vermieden werden.
4. Führen Sie das Untermakro "ROI definieren" aus, um das NMJ-Terminal von Interesse abzugrenzen
- Starten Sie die grafische Oberfläche von "Drosophila NMJ Morphometrics".
- Aktivieren Sie nur das Kontrollkästchen "ROI definieren" und drücken Sie "OK" und wählen Sie das Hauptverzeichnis aus, in dem die Bilder mit dem Titel flatstack_name gespeichert sind, und drücken Sie "Auswählen". Das Untermakro "ROI definieren" durchsucht automatisch alle Unterordner innerhalb des ausgewählten Hauptverzeichnisses.
- Wenn sich die erste Projektion öffnet, wählen Sie das Werkzeug "Freihandauswahl" in der Symbolleiste aus.
- Zeichnen Sie mit der Maus eine Auswahl, die ausschließlich das komplette NMJ-Terminal von Interesse enthält, und klicken Sie im Fenster "Terminal definieren" auf "OK". Das Makro fährt mit der nächsten Projektion fort.
- Beschreiben Sie den nächsten ROI und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle ROIs definiert sind. Die ROI-Bilddatei mit dem Namen "roi_image_name" wird im selben Verzeichnis gespeichert wie die zuvor generierten Stapel- und Projektionsbilder für jedes der verarbeiteten Bilder. Die Ausgabe dieses Untermakros ist ein binäres Bild des ROI in Weiß auf schwarzem Hintergrund.
5. Führen Sie das Untermakro "analyze" aus, um die Funktionen der NMJ-Klemmen zu quantifizieren
- Gehen Sie zur Symbolleiste, wählen Sie "Plugins" und verwenden Sie:
"Drosophila_NMJ_Morphometrics" bei der Analyse von Synapsen, die mit anti-Dlg-1 oder anti-Hrp immunmarkiert sind (Kanal 1) zusammen mit anti-Brp (Kanal 2), oder "Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics" bei der Analyse von Synapsen, die mit anti-Syt oder anti-CSP (Kanal 1) immunmarkiert sind, zusammen mit Brp (Kanal 2).
- Wenn Bildstapel mit einem Kanal analysiert werden sollen (der Strukturkanal Dlg-1 oder HRP für "Drosophila_NMJ_Morphometrics" oder Syt oder Csp für "Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics"), wählen Sie das Kontrollkästchen "Nur Kanal 1".
- Passen Sie den Maßstab entsprechend den zu analysierenden Bildern an.
- Wenn ein Pixel im Bild 2,5 μm entspricht, geben Sie Scale-Pixel = 1, Scale-Distance in μm = 2,5 an. Falls beide Einstellungen auf 0 belassen werden, werden die NMJ-Fläche, der Umfang, die Länge und die Länge des längsten Astes in Pixeln ausgedrückt.
- Passen Sie bei Bedarf die Standard-Analyseeinstellungen des Makros an. Nehmen Sie nur dann Anpassungen vor, wenn das Sub-Makro "Analysieren" zuvor mit unbefriedigenden Ergebnissen ausgeführt wurde (siehe Ende dieses Abschnitts und Abschnitt 6 für Anweisungen zur Optimierung der Einstellungen).
- Aktivieren Sie die Kontrollkästchen "Analysieren" und "Warten" und drücken Sie "OK".
- Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Warten", wenn Sie das Submakro "Analysieren" auf 2-Kanal-Bildern ausführen. Andernfalls kann es aufgrund begrenzter Rechnerkapazitäten zu Fehlern bei der aktiven Zonenzählung kommen.
- Wenn sich ein neues Fenster "Verzeichnis auswählen" öffnet, wählen Sie das Verzeichnis aus, in dem sich die Bilder befinden, und drücken Sie auf "Auswählen". Das Makro analysiert alle Bilder, die im Hauptverzeichnis und ggf. in den nachfolgenden Ordnern gespeichert sind (unter Verwendung der drei Dateien aus der Ausführung der vorherigen Untermakros: stack_image_name, flatstack_image_name und roi_image_name). Das Makro bearbeitet jedes Bild einzeln und fortlaufend. Dies kann mehrere Minuten pro Bildstapel dauern (abhängig von der Kapazität des Computers).
- Beachten Sie, dass nach dem Ausführen des Makros für jede gespeicherte analysierte Synapse eine neue Bilddatei mit dem Namen res_image_name im übergeordneten Ordner erstellt wird. Die quantitativen Messungen werden als "results.txt"-Datei gespeichert.
- Überprüfen Sie alle Ergebnisbilder, um Bilder mit Segmentierungsfehlern zu erkennen und auszuschließen. Mögliche Segmentierungsfehler werden in Tabelle 1 beschrieben, zusammen mit Ratschlägen, wie Sie die Einstellungen anpassen können, um diese Fehler zu umgehen. Ergebnisbilder mit solchen Segmentierungsfehlern finden Sie als Beispiele in Abbildung 1.
HINWEIS: Beim Ausführen des Makros mit den Standardeinstellungen, die in der Benutzeroberfläche beobachtet wurden, wurde eine Genauigkeit von ca. 95 % erreicht, wenn die Makrobewertung mit der manuellen Auswertung verglichen wurde.
6. Passen Sie die Makroeinstellungen an die Bilder an
- Wenn mehr als 5 % der Bilder Segmentierungsfehler aufweisen, erkunden Sie die verschiedenen Algorithmen, um die am besten geeigneten Makroeinstellungen für die Bilder zu definieren/auszuwählen.
- Anpassen des Werts für den Rollradius der Kugel
HINWEIS: Die Funktion "Rolling-Ball-Radius" subtrahiert den Hintergrund des Bildes. Diese Funktion ist von entscheidender Bedeutung bei der Arbeit mit Bildern, die mit Fluoreszenzmikroskopen aufgenommen wurden und/oder wenn Bilder ein hohes Hintergrundrauschen aufweisen. Die Subtraktion des Hintergrunds hilft den automatischen Schwellenwerten des Makros, eine angemessene Segmentierung der NMJ-Terminals zu erzeugen.
- Wählen Sie drei NMJ stack_image_name-Bilder aus, die mit dem Untermakro "In Stapel konvertieren" erzeugt wurden. Wählen Sie Bilder aus, die für den Bilddatensatz repräsentativ sind.
- Wählen Sie in der Symbolleiste Bild | Farbe | Kanäle teilen. Es werden zwei Bildstapel erstellt, von denen einer Kanal 1 und der andere Kanal 2 darstellt, und sie werden gespeichert.
- Öffnen Sie den Image-Stack des Kanals 1 open, der der Immunmarkierung von Dlg-1, Hrp, Syt oder Csp entspricht.
- Führen Sie den Filter "Hintergrund subtrahieren" aus, indem Sie in der Symbolleiste "Prozess" und dann im Dropdown-Menü "Hintergrund subtrahieren..." auswählen.
- Klicken Sie auf das Vorschau-Kontrollkästchen im Popup-Fenster und stellen Sie den Radius der rollenden Kugel auf den für die Bilder am besten geeigneten Wert ein. Die Einstellung "Rollkugelradius" sollte auf Werte angepasst werden, die den Kontrast zwischen Synapse und Hintergrund erhöhen (siehe Abbildung 2A").
- Ein Beispiel finden Sie unter Abbildung 2. In Panel A zeigen Teile der Synapse die gleichen Graustufen wie der Hintergrund, während in Abbildung 2 Panel A' ein "Rolling Ball Radius" von 500 einen starken Kontrast zwischen der Synapse und dem Hintergrund ergibt.
- Erstellen Sie eine Z-Projektion, indem Sie in der Symbolleiste Bild | Stapel| Z-Projektion, wählen Sie Projektionstyp = Maximale Intensität und speichern Sie das resultierende Bild. Wenn der entsprechende Wert für den Radius der rollenden Kugel definiert ist, führen Sie den Algorithmus "Hintergrund subtrahieren" für die verbleibenden repräsentativen Bilder mit demselben Wert für den Radius der rollenden Kugel aus. Erstellen Sie die Z-Projektionen und speichern Sie sie (in einem beliebigen Verzeichnis).
HINWEIS: Der Wert für den Rolling-Ball-Radius für 8-Bit- oder RGB-Bilder sollte mindestens so groß sein wie der Radius des größten Objekts im Bild, das nicht Teil des Hintergrunds ist. Bei 16-Bit- und 32-Bit-Bildern sollte der Radius umgekehrt proportional zum Pixelwertbereich sein.
- Bestimmen Sie die verschiedenen automatischen Schwellenwerte, die verwendet werden
- Öffnen Sie die im vorherigen Schritt (6.2.6) gespeicherten Z-Projektionen und wählen Sie Bild | Anpassen | Automatischer Schwellenwert | Probieren Sie alles aus.
- Da ein Ergebnis mit binärem Schwellenwert mit allen verschiedenen Algorithmen für den automatischen Schwellenwert angezeigt wird, bestimmen Sie den am besten geeigneten Algorithmus für die Bilder.
- Wenn Sie das Makro später ausführen, ändern Sie den Schwellenwert in den Makroeinstellungen entsprechend.
- Verwenden Sie restriktivere Schwellenwerte wie "RenyiEntrophy" oder "Moments" als NMJ-Gliederungsschwellenwert und freizügigere Schwellenwerte wie "Li" zum Bestimmen des NMJ-Skeletts und "Huang" zum Bestimmen aktiver Zonen. Wenn Bilder sehr scharf sind und wenig bis gar keinen Hintergrund haben, verwenden Sie "Huang" als NMJ-Umrissschwelle. Andernfalls könnten nach der Bildsegmentierung Teile der Synapse fehlen.
- Ein Beispiel finden Sie unter Abbildung 2B. Eine angemessene Segmentierung der Synapse wird mit automatischen Schwellenwerten erreicht, die durch grüne Kästchen hervorgehoben sind. Einige Beispiele für ungeeignete Schwellenwerte sind durch rote Kästchen hervorgehoben (Synapsen bei starker Vergrößerung prüfen). Bei letzterem fehlen entweder Teile der Synapse oder Teile des Hintergrunds sind enthalten.
- Bestimmen Sie die maximale Größe der kleinen Partikel
HINWEIS: Diese Funktion schließt alle Partikel aus der Analyse aus, die mit dem NMJ-Umrissschwellenwert und dem Skelett-Schwellenwert erkannt wurden und kleiner als der in der Einstellung "kleine Partikel" definierte Wert sind. Dieser Wert wird in Pixel definiert. Diese Funktion dient als Rauschfilter und ist sehr nützlich, wenn in den erhaltenen Bildern hohe Raten von ungleichmäßigem Hintergrund (wie Kristalle/Staub) vorhanden sind.
- Öffnen Sie die in Schritt 6.2.6 gespeicherten Z-Projektionen und stellen Sie die Skala so ein, dass die Anzahl der Pixel über Analysieren | Festlegen der Skalierung. Nehmen Sie folgende Einstellungen vor: Abstand in Pixel = 1, bekannter Abstand = 1, Pixel-Seitenverhältnis = 1, Längeneinheit = Pixel und drücken Sie "Ok". Klicken Sie auf das Werkzeug "Ovale Auswahl" in der Symbolleiste.
- Zeichnen Sie mit der Maus eine Selektion dicht um einzelne Partikel, die in der Immunfärbung vorhanden sind, aber nicht zum NMJ gehören. Drücken Sie Strg+m für Windows-Benutzer oder cmd+m für Mac-Benutzer. Es öffnet sich ein Ergebnisfenster, in dem der Bereich der ausgewählten Partikel in Pixeln angegeben ist.
- Wiederholen Sie den vorherigen Schritt mehrmals mit mehreren Artefakten, die in den Bildern vorhanden sind, um den größten kontaminierenden Partikel-/Artefaktbereich zu bestimmen. Dies ist der Wert, der in der Einstellung festgelegt werden soll, wenn das Makro später ausgeführt wird. Wenn Sie das Makro ausführen, stellen Sie die "Kleine Partikelgröße" als kleinste beobachtete Partikelgröße ein, was einem Spielraum von 25% entspricht.
- Siehe Abbildung 2D für ein Beispiel. Der größte detektierte Kristall hat eine Fläche von 112 Pixeln. Die Einstellung "Kleine Partikelgröße" sollte bei der Bearbeitung dieses Bildes mit dem Makro auf 125 - 150 eingestellt werden.
- Bestimmen Sie die Mindestgröße des Boutons
HINWEIS: Diese Funktion schließt alle vom NMJ-Konturschwellenwert erkannten Boutons aus, die kleiner als der definierte Wert sind, aus der Analyse. Dieser Wert wird in Pixel definiert.
- Befolgen Sie die gleichen Schritte wie in Abschnitt 6.4 beschrieben, aber ziehen Sie in diesem Fall eine Auswahl um die kleinsten Boutons im NMJ-Terminal. Wählen Sie die kleinste Fläche, die dem kleinsten Bouton der gemessenen Boutons entspricht. Dies ist der Wert, der in der Einstellung für die minimale Bouton-Größe festgelegt werden soll, wenn das Makro später ausgeführt wird.
- Definieren Sie den Wert "Maxima noise tolerance"
- Um den Wert "Maximale Rauschtoleranz ermitteln" für das Makro zu definieren, öffnen Sie den Z-Stack von Kanal 2, der in Abschnitt 6.2.2 gespeichert ist.
- Gehen Sie im Popup-Menü auf die Registerkarte Plugins, wählen Sie Prozess | Maximum(3D), und wenn das maximum_image_name angezeigt wird (was einige Minuten dauern kann), schließen Sie den ursprünglichen Bildstapel.
- Wählen Sie das Maximum..._image_name (den neu abgerufenen Image-Stack) aus und wählen Sie Plugins | Prozess | Minimum (3D), wenn das neue Bild Minimum von Maximum..._image_name den Stapel Maximum... _image_name schließt.
- Wählen Sie in der Symbolleiste Prozess | Finde Maxima.... Es öffnet sich ein neues Fenster "Maxima finden...". Klicken Sie auf das Kontrollkästchen "Vorschau der Punktauswahl..." und füllen Sie das Feld "Rauschtoleranz" mit der Standard-Makroeinstellung 50. Die Maxima-Punkte werden im Bild als kleine Kreuze angezeigt.
- Erhöhen Sie den Wert für "Rauschtoleranz", wenn ein Überschuss an annotierten aktiven Zonen beobachtet wird, d. h. Kreuze, die nicht über aktiven Zonen liegen, die auf der ausgewählten Stapelebene nicht im Fokus sind, oder falsche aktive Zonen, die im Hintergrund erkannt werden.
- Wenn hingegen unvollständig annotierte aktive Zonen beobachtet werden, d.h. aktive Zonen im Fokus nicht erkannt werden, verringern Sie den Wert "Maxima noise tolerance". Probieren Sie nach diesem Verfahren immer wieder andere Werte aus, bis die Kreuze die aktiven Zonen im Fokus entsprechend beschriften. Füllen Sie das Feld "Maxima Rauschtoleranz ermitteln" mit diesem Wert.
- Ein Beispiel finden Sie unter Abbildung 2C. Es werden zu viele aktive Zonen erkannt. In Abbildung 2C' werden nur die aktiven Zonen im Fokus erkannt, wenn der Wert für "Maxima noise tolerance" erhöht wird.
- Führen Sie das Untermakro "Analysieren" für die repräsentativen Bilder aus, die in Schritt 5.1 ausgewählt wurden, mit den Einstellungen, die Sie in allen vorherigen Schritten definiert haben.
- Anpassen des unteren und oberen Schwellenwerts von Brp-puncta
- Beachten Sie, dass nach dem Ausführen des Makros gemäß Schritt 6.6 eine neue Datei mit dem Namen 2_active_zone_stack_image_name angezeigt wird. In diesem Bildstapel werden die aktiven Zonen, die von der Funktion "Maxima finden" erkannt werden, durch weiße Punkte in jeder Ebene angezeigt.
- Öffnen Sie diese Datei, indem Sie sie per Drag & Drop in die Symbolleiste ziehen und Bild | Stapel | Z-Projekt | Projektionstyp = Summen-Segmente. Es wird eine Hochrechnung der 2_active_zone_stack_image_name erstellt.
- Bild auswählen | Anpassen | Schwelle. Es öffnet sich ein neues Fenster "Schwelle". Schieben Sie den oberen Balken, um einen Schwellenwert auszuwählen, bei dem alle gewünschten Fokuse/Brp-positiven Punkte rot dargestellt werden.
HINWEIS: Wenn der Schwellenwert zu niedrig angesetzt ist, wird ein Überschuss an aktiven Zonen gezählt. Wenn die Einstellung zu hoch ist, wird ein Bruchteil der aktiven Zonen übersehen.
- Ein Beispiel finden Sie unter Abbildung 2E. Wenn der Schwellenwert auf 400 festgelegt ist, werden die meisten aktiven Zonen (symbolisiert als 1-Pixel-Fokus) nicht in die Segmentierung einbezogen, da sie nicht rot hervorgehoben werden (Abbildung 2E). Wenn der Schwellenwert auf einen Wert von 50 eingestellt ist, werden alle aktiven Zonen rot hervorgehoben (Abbildung 2E").
- Definieren Sie diesen Wert als minimalen Schwellenwert. Belassen Sie "Oberer Punktschwellenwert" auf dem Maximalwert.
- Führen Sie das Untermakro "Analysieren" für die repräsentativen Bilder mit den Einstellungen aus, die Sie in allen vorherigen Schritten dieses Abschnitts definiert haben. Bewerten Sie die resultierenden Bilddateien kritisch und stellen Sie sicher, dass die Segmentierung ordnungsgemäß durchgeführt wird. Ist dies nicht der Fall, passen Sie die Einstellungen entsprechend der Art der Segmentierungsfehler an (Abbildung 1, Tabelle 1).
