Zwei-Photonen-Laser-induzierte neuronale Verletzung: Eine Methode zur Beobachtung der Axondegeneration und -regeneration bei Drosophila-Larven

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Li et al., A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System, J. Vis. Exp. (2018).

1. Zwei-Photonen-Verletzung und konfokale Bildgebung

1. Aufbau des Mikroskops
   HINWEIS: Für dieses Experiment wurde ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Zwei-Photonen-Laser verwendet, aber auch andere Systeme mit einem gleichwertigen Aufbau reichen aus. Der Zwei-Photonen-Laser (930 nm) wurde für die Verabreichung von Verletzungen und ein Argon-Laser (488 nm) für die konfokale Bildgebung von GFP verwendet.
   1. Schalten Sie zu Beginn jeder Sitzung den Zwei-Photonen-Laser und/oder den/die konfokalen Laser(n) und das Mikroskop ein. Öffnen Sie die Imaging-Software.
   2. Für eine Zwei-Photonen-Verletzung stellen Sie die folgenden Parameter für die Abbildung von GFP mit dem Zwei-Photonen-Laser bei 930 nm (1.950 mW) ein.
      1. Wählen Sie den Zeilenscan-Modus. Öffne die Lochblende ganz offen. Erhöhen Sie die Laserintensität auf ~20 % (390 mW).
      2. Wählen Sie 512 x 512 als Frame-Scan. Verwenden Sie die maximale Scangeschwindigkeit (in der Regel mit einer Pixelverweilzeit von 0,77 μs). Stellen Sie sicher, dass die durchschnittliche Anzahl 1 und die Bittiefe 8 Bit beträgt.
      3. Stellen Sie die Verstärkung auf ~750 und den Offset auf 0 ein.
      4. Speichern Sie dieses voreingestellte Versuchsprotokoll als 2P GFP 930-Ablation, um eine einfache Wiederverwendung in zukünftigen Experimenten zu ermöglichen.
   3. Für die konfokale Bildgebung stellen Sie die folgenden Parameter für die Abbildung von GFP mit dem Argon-Laser bei 488 nm ein:
      1. Wählen Sie die Registerkarte Erfassung und dann Z-Stapel aus.
      2. Schalten Sie unter "Laser" das Gerät für den 488-nm-Argon-Laser ein.
      3. Gehen Sie zu Kanäle, wählen Sie den 488-mm-Laser aus und erhöhen Sie die Laserleistung auf 5-10 %. Für die Lochblende verwenden Sie die 1-2 luftige Einheit (AU). Stellen Sie die Verstärkung auf 650 ein.
      4. Wählen Sie im Erfassungsmodus 1024 x 1024 als Frame-Scan aus, verwenden Sie die maximale Scangeschwindigkeit, eine durchschnittliche Anzahl von 2 und eine Bittiefe von 8 Bit.
      5. Speichern Sie dieses voreingestellte Versuchsprotokoll als GFP Imaging.
2. Larvenanästhesie mit Diethylether und Halterung
   1. Stellen Sie eine 60-mm-Glasschale in einen Abzug in eine 15 cm dicke Petrischale aus Kunststoff. Falten Sie ein Stück Seidenpapier und legen Sie es auf den Boden der Glasschale, dann legen Sie eine Traubensaft-Agar-Platte auf das Taschentuch. Gib Diethylether in die Glasschale, bis zu dem Punkt, an dem das Seidenpapier durchnässt ist und eine Schicht aus flüssigem Äther in der Schale zurückbleibt. Halten Sie den Deckel immer auf.
   2. Bereiten Sie einen Objektträger mit einem Tropfen Halogenkohlenwasserstoff-27-Öl in der Mitte vor. Geben Sie 4 Flecken Vakuumfett auf die vier Ecken des Objektträgers, um das Deckglas später zu stützen.
   3. Nehmen Sie mit einer Pinzette eine gereinigte Larve auf und legen Sie sie auf die Agarplatte in der 60-mm-Glasschale. Decken Sie die Glasschale mit dem Deckel ab und warten Sie, bis sich die Larve nicht mehr bewegt. Für PNS-Verletzungen/Bildgebung nehmen Sie die Larve heraus, sobald ihr Schwanz aufhört zu zucken. Warten Sie beim ZNS, bis die gesamte Larve bewegungslos wird, insbesondere die Kopfsegmente.
      HINWEIS: Der Zeitpunkt der Ether-Exposition ist entscheidend. Siehe Diskussion.
   4. Heben Sie die betäubte Larve vorsichtig auf und legen Sie sie mit dem Kopf aufrecht in den Tropfen Halogenkohlenwasserstofföl auf dem Objektträger. Füge ein Deckglas auf die Folie auf. Drücken Sie mit leichtem Druck auf das Deckglas, bis es die Larve berührt (Abbildung 1A).
   5. Passen Sie die Position der Larve an, indem Sie das Deckglas vorsichtig nach links oder rechts schieben, um die Larve zu rollen, so dass das interessierende Neuron/Axon/Dendrit oben und am nächsten an der Mikroskoplinse ist.
   6. Bei PNS-Verletzungen die Larve mit der Rückenseite nach oben montieren, so dass beide Luftröhren sichtbar sind. Rollen Sie dann die Larve ~30 Grad nach links, um Neuronenaxone der Klasse III zu verletzen (Abbildung 1B und 1C), 90 Grad, um Neuronenaxone der Klasse IV zu verletzen (Abbildung 1B und 1E), oder ~30 Grad, um Neuronendendriten der Klasse IV zu verletzen (Abbildung 2A).
   7. Bei ZNS-Verletzungen positionieren Sie die Larve perfekt mit der Bauchseite nach oben (Abbildung 3A), so dass der interessierende Bereich der Mikroskoplinse in der z-Ebene am nächsten ist.
3. Verletzung durch Zwei-Photonen-Laser
   1. Legen Sie den Objektträger mit der Larve unter das Mikroskop und befestigen Sie ihn mit dem Objektträgerhalter auf dem Tisch. Benutze das 10-fache (0,3 NA) Ziel, um die Larve zu finden.
   2. Geben Sie 1 Tropfen Objektivöl auf das Deckglas, wechseln Sie zum 40X (1,3 NA) Objektiv und stellen Sie den Fokus ein.
   3. Wechseln Sie in den Scan-Modus und verwenden Sie das experimentelle Protokoll 2P GFP 930 Ablation wieder. Stellen Sie sicher, dass die Lochblende vollständig geöffnet ist.
      HINWEIS: Die Konfiguration muss auf Basis der einzelnen Systeme optimiert werden.
   4. Starten Sie den Live-Modus, um den Bereich of Interest (ROI) zu lokalisieren, und passen Sie die Einstellungen an, um mit dem entsprechenden Zoom eine gute Bildqualität zu erzielen.
      HINWEIS: Der Zweck dieses Schritts besteht darin, das Neuron/Axon/Dendriten zu finden, das verletzt werden soll, anstatt das Bild mit der besten Qualität aufzunehmen. Verwenden Sie daher die minimalen Einstellungen, die ausreichen, um den Zielbereich zu visualisieren, um Überbelichtung oder Photobleaching zu vermeiden.
   5. Stoppen Sie den Live-Scan, sodass die Schaltfläche Zuschneiden verfügbar wird. Lassen Sie das Standbild als Roadmap dienen. Wählen Sie die Funktion Zuschneiden und passen Sie das Scan-Fenster so an, dass es sich auf das zu verletzende Ziel konzentriert.
   6. Reduzieren Sie den ROI auf die Größe der potenziellen Verletzungsstelle. Decken Sie zum Beispiel einfach die Breite eines Axons oder eines Dendriten ab, um die Präzision der Verletzung zu gewährleisten und die Schädigung benachbarter Gewebe zu reduzieren. Falls gewünscht, können Sie den ROI vor dem Zuschneiden vergrößern, um präzisere Verletzungen zu ermöglichen.
   7. Öffnen Sie ein neues Imaging-Fenster. Reduzieren Sie die Scangeschwindigkeit und erhöhen Sie die Laserintensität. Bestimmen Sie die Erhöhung der Laserintensität basierend auf dem Gewebefluoreszenzsignal, das im Live-Modus gescannt wird.
   8. Stellen Sie in der Regel die Zwei-Photonen-Laserintensität ab 25 % für PNS-Verletzungen und 50-100 % für VNC-Verletzungen ein. Bei PNS-Axonverletzungen ist darauf zu achten, dass die Laserintensität ~480 mW und die Pixelverweilzeit 8,19 μs beträgt. Stellen Sie bei der Verletzung des VNC-Axons sicher, dass die Laserintensität und die Pixelverweilzeit in der Regel 965-1930 mW bzw. 8,19-32,77 μs betragen.
   9. Starten Sie den kontinuierlichen Scan. Lassen Sie den Cursor über die Schaltfläche Kontinuierlich. Behalten Sie das Bild genau im Auge und stoppen Sie den Scan, sobald ein drastischer Anstieg der Fluoreszenz beobachtet wird.
      HINWEIS: Das Auftreten des Fluoreszenz-Spikes ist auf die Autofluoreszenz an der Verletzungsstelle zurückzuführen.
   10. Wechseln Sie zurück in den Live-Modus, indem Sie die Einstellungen wiederverwenden. Ermitteln Sie den Interessenbereich, der gerade angesprochen wurde, indem Sie den Fokus anpassen.
       HINWEIS: Ein guter Hinweis auf eine erfolgreiche Verletzung ist das Auftreten eines kleinen Kraters, einer ringförmigen Struktur oder lokalisierter Trümmer direkt an der Verletzungsstelle.
   11. Wechseln Sie zum nächsten Neuron und wiederholen Sie den Vorgang ab Schritt 1.3.5, um mehrere Neuronen in einem einzigen Tier zu verletzen. Oder wiederholen Sie Schritt 1.3.5, während Sie die Leistung schrittweise erhöhen und/oder die Scangeschwindigkeit verringern, wenn die ursprüngliche Verletzung unzureichend war.
       HINWEIS: Für den Fall, dass die Laserleistung zu hoch ist, wird auf dem Live-Scan-Bild nach der Verletzung ein großer beschädigter Bereich sichtbar. Zu starke Verletzungen können zum Tod der Larve führen.
   12. Erholen Sie die Larve, indem Sie das Deckglas vorsichtig entfernen und die verletzte Larve auf eine neue Platte mit Hefepaste setzen. Graben Sie mehrere Höhlen auf der Agarplatte mit einer Pinzette; Alternativ können Sie eine Insel Agar in die Platte legen, anstatt die ganze Platte zu verwenden, um die Möglichkeit zu verringern, dass die Larve aus der Platte kriecht.
   13. Die Platte in eine 60-mm-Petrischale mit feuchtem Tuch (getränkt mit 0,5%iger Propionsäurelösung) legen und bei Raumtemperatur oder 25 °C kultivieren.
       HINWEIS: Die Larve verbleibt bei Raumtemperatur (22 °C) im Vergleich zu 25 °C etwa einen Tag länger im Larvenstadium.
4. Konfokale Bildgebung nach Verletzungen
   1. Bilden Sie die verletzte Larve zu den gewünschten Zeitpunkten ab, indem Sie die Larve mit dem gleichen Verfahren der Anästhesie und Montage wie in Schritt 1.2 vorbereiten und dann mit dem konfokalen Laser abbilden.
      HINWEIS: Die Larve wird 24 h nach der Verletzung (AI) abgebildet, um die axonale Verletzung zu bestätigen, und nach 48 h AI (Neuronen der Klasse IV da) oder 72 h AI (Neuronen der Klasse III da), um die Regeneration zu beurteilen.
   2. Lokalisiere die Larve mit dem 10-fachen Objektiv und wechsle dann zu einem 25-fachen Objektiv (0,8 NA). Verwenden Sie das experimentelle Protokoll GFP Imaging wieder.
   3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Live und suchen Sie das gleiche Neuron, das zuvor verletzt wurde.
   4. Legen Sie die erste und letzte Z-Position im Live-Scan-Fenster fest. Drücken Sie Stopp und klicken Sie auf Experiment starten, um ein Z-Stapel-Bild zu erfassen.
      HINWEIS: Es ist darauf zu achten, dass bei der Bildaufnahme ein Normalisierungspunkt (der Axonkonvergationspunkt) enthalten ist, damit eine Quantifizierung der Regeneration möglich ist (Abbildung 1D, 1F) – dies wird im Abschnitt Datenanalyse weiter erläutert.
   5. Wechseln Sie zur Bildverarbeitung, wählen Sie das gerade aufgenommene Bild aus und generieren Sie eine Projektion mit maximaler Intensität. Speichern Sie sowohl das Z-Stapel-Bild als auch das Projektionsbild mit maximaler Intensität.

Abbildung 1: Die Regeneration von Neuronenaxonen in der Peripherie zeigt Klassenspezifität. (A und B) Schematische Zeichnung, die die Position der Larven zeigt. (C) Schematische Zeichnung von Neuronen der Klasse III da. (D) Axone der Klasse-III-da-Neuronen ddaF, markiert mit 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, wachsen nicht nach. (E) Schematische Zeichnung von Neuronen der Klasse IV da. (F) Axone der Klasse IV da Neuronen v'ada, markiert mit ppk-CD4-tdGFP/+, wachsen über die Läsionsstelle hinaus nach. (D und F) Die rote Linie zeigt die Axonlänge an, während die grüne gestrichelte Linie den Abstand zwischen dem Zellkörper und dem Axonkonvergationspunkt (DCAC) markiert. Der blaue Punkt markiert den Axon-Konvergationspunkt. Maßstabsleiste = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Da Neuron Dendriten Regeneration. (A) Illustrative Darstellung von Neuronen der Klasse IV da. (B) Illustrative Darstellung der Dendritenregeneration in einem dda-Neuron der Klasse IV, markiert mit ppk-CD4-tdGFP/+. Die Laserablation zielt auf den primären Astpunkt ab und wird bei 48 h AEL durchgeführt. Nach 24 h AI wird die Verletzungsdurchtrennung des Neurits bestätigt, und nach 72 h ist die AI-Regeneration quantifiziert. Dendriten von ddaC-Neuronen zeigen ein erhebliches Nachwachsen, wobei neue dendritische Äste aus dem abgetrennten Stamm sprießen, um den freien Raum zu kacheln. Es ist erwähnenswert, dass den unverletzten Dendriten in diesem Entwicklungsstadium kontinuierlich neue Endäste hinzugefügt werden. Maßstabsleiste = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Da Neuron Axon Regeneration im VNC. (A) Schematische Zeichnung einer Drosophila-Larve, die auf einen Objektträger montiert und unter dem Mikroskop abgebildet wurde. Klasse IV da Neuronenaxone im VNC, visualisiert in einer ppk-CD4tdGFP/+ Larve. Im vergrößerten Bild und in der schematischen Zeichnung werden zwei mögliche Kommissursegmente angezeigt. Jeder von ihnen hat zwei Verletzungsstellen (rote Kreise). (B) Konfokale Bilder eines verletzten Segments, aufgenommen 8, 24 und 72 Stunden nach der Verletzung (AI). Rote Linien zeigen die nachwachsenden Axone. (C) Messung und Normalisierung nachwachsender Axone. Maßstabsleiste = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.