Lesión neuronal inducida por láser de dos fotones: un método para observar la degeneración y regeneración del axón en larvas de drosophila

Overview

Este video describe la ablación láser de dos fotones de axones en una larva de Drosophila melanogaster y un protocolo de ejemplo para inducir lesiones e imagen del sitio de lesiones.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Li et al., A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System, J. Vis. Exp. (2018).

1. Lesión de dos fotones e imágenes confocales

1. Configuración del microscopio
   NOTA: Se utilizó un microscopio de escaneo láser confocal con un láser de dos fotones para este experimento, pero otros sistemas con una configuración equivalente también serán suficientes. El láser de dos fotones (930 nm) se utilizó para la entrega de lesiones y un láser de argón (488 nm) se utilizó para la toma de imágenes confocales de GFP.
   1. Al comienzo de cada sesión, encienda el láser de dos fotones y/o los láseres confocales y el microscopio. Abra el software de imágenes.
   2. Para lesiones de dos fotones, configure los siguientes parámetros para la toma de imágenes de GFP con el láser de dos fotones a 930 nm (1.950 mW).
      1. Seleccione el modo de escaneo de línea. Abre el agujero hasta el final. Aumentar la intensidad del láser a ~20% (390 mW).
      2. Seleccione 512 x 512 como escaneo de fotogramas. Utilice la velocidad máxima de escaneo (normalmente con el tiempo de permanencia del píxel a 0,77 μs). Asegúrese de que el número promedio es 1 y la profundidad de bits es de 8 bits.
      3. Establezca la ganancia en ~750 y el desplazamiento en 0.
      4. Guarde este protocolo experimental preescendiendo como Ablación 2P GFP 930,lo que permite una fácil reutilización en futuros experimentos.
   3. Para imágenes confocales, configure los siguientes parámetros para la GFP por imágenes con el láser Argón a 488 nm:
      1. Seleccione la pestaña Adquisición y, a continuación, pila Z.
      2. Bajo"Láser",encienda la potencia del láser argón de 488 nm.
      3. Vaya a Canales,seleccione el láser de 488 mm y aumente la potencia láser a 5-10%. Para el agujero, utilice la unidad ventilada (AU) 1-2. Ajuste la ganancia a 650.
      4. En modo de adquisición, seleccione 1024 x 1024 como escaneo de fotogramas, utilice la velocidad máxima de escaneo, un número medio de 2 y una profundidad de bits de 8 bits.
      5. Guarde este protocolo experimental preespado como imágenes GFP.
2. Anestesia larvaria con éter de dietil y montaje
   1. En una capucha de humo, coloque una placa de vidrio de 60 mm en una placa de petri de plástico de 15 cm. Doble y coloque un pedazo de papel tisú en la parte inferior del plato de vidrio, luego coloque un plato de agar de jugo de uva en el tejido. Agregue el éter de dietil en el plato de vidrio, hasta el punto en que el papel tisular esté empapado y que quede una capa de éter líquido en el plato. Mantenga la tapa encendida en todo momento.
   2. Prepara un tobogán de vidrio con una gota de aceite de halocarbono 27 en el centro. Añadir 4 manchas de grasa de vacío en las cuatro esquinas de la diapositiva, para posteriormente apoyar el deslizamiento de cubierta.
   3. Utilice fórceps para recoger una larva limpiada y colocarla en la placa de agar en el plato de vidrio de 60 mm. Cubra el plato de vidrio con su tapa y espere hasta que la larva deje de moverse. Para lesiones/imágenes de PNS, saque la larva tan pronto como su cola deje de temblar. Para el SNC, espere hasta que toda la larva se vuelva inmóvil, especialmente los segmentos de la cabeza.
      NOTA: El momento de la exposición al éter es crítico. Consulte Discusión.
   4. Recoge cuidadosamente la larva anestesiada y colóquela de cabeza en la gota de aceite de halocarbono en el tobogán. Agregue un punto de cubierta en la parte superior de la diapositiva. Utilice una presión suave para empujar hacia abajo en la cubierta, hasta que toque la larva (Figura 1A).
   5. Ajuste la posición de la larva empujando suavemente la mancha hacia la izquierda o la derecha para rodar la larva, de modo que la neurona/axón/dendrita de interés esté en la parte superior y más cercana a la lente del microscopio.
   6. Para la lesión de PNS, monte la larva dorsal hacia arriba, para que ambas tráqueas sean visibles. A continuación, enrolle la larva ~ 30 grados a la izquierda para lesionar axones de clase III da neuron (Figura 1B y 1C), 90 grados para lesionar axones da neuronas clase IV (Figura 1B y 1E), o ~ 30 grados para lesionar la clase IV da neuron dendritas (Figura 2A).
   7. Para la lesión del SNC, coloque la larva para que sea perfectamente ventral hacia arriba(Figura 3A),de modo que la región de interés esté más cerca de la lente del microscopio en el plano z.
3. Lesión por láser de dos fotones
   1. Coloque el tobogán con la larva debajo del microscopio y fíjelo en su lugar con el portaobjetos en el escenario. Utilice el objetivo 10X (0.3 NA) para encontrar la larva.
   2. Agregue 1 gota de aceite objetivo en el deslizamiento de cubierta, cambie al objetivo 40X (1.3 NA) y ajuste el enfoque.
   3. Cambie al modo de escaneo y vuelva a utilizar el protocolo experimental 2P GFP 930 Ablación. Asegúrese de que el agujero esté abierto todo el camino.
      NOTA: La configuración debe optimizarse en función de sistemas individuales.
   4. Inicie el modo Live para localizar la región de interés (ROI) y ajuste los ajustes para lograr una buena calidad de imagen con el zoom adecuado.
      NOTA: El propósito de este paso es encontrar la neurona / axón / dendrita para herir, en lugar de tomar la mejor imagen de calidad. Por lo tanto, utilice los ajustes mínimos suficientes para visualizar el área objetivo, con el fin de evitar la sobreexposición o el fotobleaching.
   5. Detenga la exploración en vivo, de modo que el botón Recortar esté disponible. Deje que la imagen fija sirva como hoja de ruta. Seleccione la función Recortar y ajuste la ventana de escaneado para centrarse en el objetivo que se va a lesionar.
   6. Reduzca el ROI para que sea del tamaño del posible sitio de lesiones. Por ejemplo, basta con cubrir la anchura de un axón o un dendrita, para garantizar la precisión de la lesión y reducir el daño a los tejidos vecinos. Si lo desea, acerque el ROI antes de recortar, lo que permite lesiones más precisas.
   7. Abra una nueva ventana de imágenes. Reduzca la velocidad de escaneo y aumente la intensidad del láser. Determine el aumento de la intensidad del láser en función de la señal de fluorescencia tisular escaneada en el modo Live.
   8. Por lo general, establezca la intensidad del láser de dos fotones a partir del 25% para la lesión de PNS y del 50-100% para la lesión de VNC. Para la lesión del axón PNS, asegúrese de que la intensidad del láser sea ~480 mW y el tiempo de permanencia de píxeles sea de 8,19 μs. Para la lesión del axón VNC, asegúrese de que la intensidad del láser y el tiempo de permanencia de los píxeles suelen ser de 965-1930 mW y 8,19-32,77 μs, respectivamente.
   9. Inicie la exploración continua. Deje el cursor sobre el botón Continuo. Mantenga un ojo cercano en la imagen y detenga la exploración tan pronto como se observe un aumento drástico de la fluorescencia.
      NOTA: La aparición del pico de fluorescencia se debe a la fluorescencia automática en el sitio de la lesión.
   10. Vuelva al modo En vivo reutilizando la configuración. Encuentre la región de interés a la que acaba de apuntar ajustando el enfoque.
       NOTA: Una buena indicación de lesiones exitosas es la aparición de un pequeño cráter, estructura similar a un anillo o escombros localizados justo en el sitio de la lesión.
   11. Muévete a la siguiente neurona y repite desde el Paso 1.3.5, para herir múltiples neuronas en un solo animal. O repita el paso 1.3.5 mientras aumenta gradualmente la potencia y/o reduce la velocidad de escaneo si la lesión inicial es insuficiente.
       NOTA: En el caso de que la potencia del láser sea demasiado alta, una gran área dañada será visible en la imagen de escaneo en vivo después de la lesión. Demasiada lesión puede causar la muerte de la larva.
   12. Recuperar la larva mediante la extracción cuidadosa de la mancha de cubierta y la transferencia de la larva lesionada a un nuevo plato con pasta de levadura. Deshazte de varias cuevas en la placa del agar con fórceps; alternativamente, hacer una isla de agar en la placa en lugar de utilizar todo el plato, para reducir la posibilidad de que la larva se arrastre fuera de la placa.
   13. Coloque la placa en una placa Petri de 60 mm con tejido húmedo (empapado con solución de ácido propionico al 0,5%) y cultivo a temperatura ambiente o a 25 °C.
       NOTA: La larva permanecerá en la etapa larvaria durante aproximadamente un día adicional a temperatura ambiente (22 °C) en comparación con 25 °C.
4. Imágenes confocales post-lesión
   1. Imagine la larva lesionada en los puntos de tiempo deseados preparando la larva utilizando el mismo procedimiento de anestesia y montaje que en el paso 1.2, luego imágenes con el láser confocal.
      NOTA: Imagen de la larva a las 24 h después de una lesión (IA) para confirmar una lesión axonal y a 48 h AI (clase IV da neuronas) o 72 h IA (clase III da neuronas) para evaluar la regeneración.
   2. Localice la larva usando el objetivo 10X, luego cambie a un objetivo 25X (0.8 NA). Reutilizar el protocolo experimental GFP Imaging.
   3. Haga clic en el botón Vivir y encuentre la misma neurona lesionada anteriormente.
   4. Establezca las primeras y últimas posiciones Z en la ventana de escaneo en vivo. Pulse Detener y haga clic en Iniciar experimento para adquirir una imagen de pila Z.
      NOTA: Asegúrese de que se incluya un punto de normalización (el punto convergente del axón) al capturar imágenes para que sea posible la cuantificación de la regeneración (Figura 1D, 1F), esto se discute más adelante en la sección de análisis de datos.
   5. Cambie a Procesamiento de imágenes,seleccione la imagen que acaba de tomar y genere una proyección de máxima intensidad. Guarde las imágenes de proyección de velocidad z y máxima intensidad.

Representative Results

Figura 1: La regeneración del axón de la neurona da en la periferia muestra especificidad de la clase. (A y B) Dibujo esquemático que muestra la posición de las larvas. (C) Dibujo esquemático de la clase III da neuronas. (D) Los axones de la clase III da neurons ddaF, etiquetados con 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, no pueden volver a crecer. (E) Dibujo esquemático de la clase IV da neuronas. (F) Axones de la clase IV da neurons v'ada, etiquetados con ppk-CD4-tdGFP/+, vuelven a crecer más allá del sitio de la lesión. (D y F) La línea roja indica la longitud del axón, mientras que la línea discontinua verde marca la distancia entre el cuerpo de la célula y el punto convergente del axón (DCAC). El punto azul marca el punto convergente del axón. Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Regeneración de dendrita de la neurona. (A) Representación ilustrativa de la clase IV da neuronas. (B) Representación ilustrativa de la regeneración de dendrita en la clase IV da neuron ddaC, etiquetada por ppk-CD4-tdGFP/+. La ablación láser está dirigida al punto de rama principal y se lleva a cabo a las 48 h AEL. A las 24 h Se confirma la transección por lesión de IA del neurite, y a las 72 h se cuantifica la regeneración de la IA. Los dendritas de las neuronas ddaC demuestran un crecimiento sustancial, con nuevas ramas dendríticas brotando del tallo cortado para azulejos del espacio vacante. Vale la pena señalar que las nuevas ramas terminales se añaden continuamente a los dendritas no heridos en esta etapa de desarrollo. Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Regeneración del axón de la neurona da en el VNC. (A) Dibujo esquemático de una larva de Drosophila montada en una diapositiva e imagen bajo el microscopio. Axones de neuronas de clase IV en el VNC visualizados en una larva ppk-CD4tdGFP/+. Dos segmentos de comisario candidatos se muestran en la imagen ampliada y el dibujo esquemático. Cada uno de ellos tiene dos sitios de lesiones (círculos rojos). B) Imágenes confocales de un segmento lesionado imágenes a las 8, 24 y 72 h después de una lesión (IA). Las líneas rojas representan los axones de rebrote. (C) Medición y normalización de axones de rebrote. Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent