Mikroinjektion von Drosophila-Ammenzellen: Eine Methode der intrazellulären Verabreichung

Zusammenfassung

Quelle: Catrina, I. E., et al. Visualisierung und Verfolgung endogener mRNAs in lebenden Drosophila melanogaster Eikammern. J. Vis. Exp. (2019).

Aufgrund ihrer Größe und relativ einfachen Organisation sind Drosophila-Ammenzellen ideal für Lebendzell-Bildgebungsstudien geeignet. Dieses Video beschreibt eine Mikroinjektionsmethode für die Verabreichung exogener Verbindungen in die Zellen, und das vorgestellte Protokoll demonstriert das Verfahren mit fluoreszierenden Oligonukleotidsonden, den sogenannten Molecular Beacons (MBs), die zur Visualisierung endogener mRNA-Transkripte verwendet werden.

Protokoll

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Catrina et al., Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019).

1. Design von MBs für die Bildgebung lebender Zellen

1. Falten Sie die Ziel-RNA-Sequenz, um die Sekundärstruktur des mRNA-Ziels mithilfe der "RNA-Form" vom mfold-Server vorherzusagen (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
   1. Fügen Sie die Zielsequenz im FASTA-Format ein/laden Sie sie hoch, wählen Sie 5 oder 1....

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Spektrofluorometer	Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon	n/a	Photonenzähl-Spektrofluorometer
Quarz-Küvette	Fireflysci (ehemals Precision Cells Inc.)	701MFL
Dumont #5 Pinzette	Welt Präzisionsinstrumente	501985	Eine dünne Pinzette ist sehr wichtig, um die einzelnen Eikammern zu trennen
Halogenkohlenwasserstoff-Öl 700	Sigma-Aldrich	Nr. H8898
Deckglas Nr.1 22 mm x 40 mm	VWR	Artikel-Nr.: 48393-048
Präpariermikroskop	Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.	n/a
CO2-Fruchtfliegen-Anästhesiepad	Genesee Scienific	Nr. 59-114
Tris-HCL pH 7,5	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 1185-53-1
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 7791-18-6
NaCl	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 7647-14-5
Konfokales Spinning-Disc-Mikroskop	Inverses Mikroskop Leica DMI-4000B mit Yokogawa CSU 10 Spinning Disc Leica Microsystems Inc.	n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD-Kamera	Hamamatsu	n/a
PatchMan NP 2 Mikromanipulator	Eppendorf Inc.	920000037
FemtoJet Mikroinjektor	Eppendorf Inc.	920010504
Injektionsnadel: Femtotips II	Eppendorf Inc.	930000043
Tipp zum Laden: 20 μL Microloader	Eppendorf Inc.	930001007
Micro Cover Brille Nr. 1 oder 1,5, 22 mm x 40 mm	VWR	Tel.: 48393-026; 48393-172
Trockenhefe	Jedes Lebensmittelgeschäft	n/a
Computer, > 20 GB RAM			Obwohl die Verarbeitung auf den meisten Computern durchgeführt werden kann, erhöhen höhere Funktionen die Geschwindigkeit der Verarbeitung