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Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Catrina et al., Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019).
1. Design von MBs für die Bildgebung lebender Zellen
- Falten Sie die Ziel-RNA-Sequenz, um die Sekundärstruktur des mRNA-Ziels mithilfe der "RNA-Form" vom mfold-Server vorherzusagen (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
- Fügen Sie die Zielsequenz im FASTA-Format ein/laden Sie sie hoch, wählen Sie 5 oder 10 % Suboptimalität (Strukturen mit einer freien Faltungsenergie innerhalb von 5 bzw. 10 % des MFE-Wertes) und passen Sie die maximale Anzahl der berechneten Faltungen entsprechend an (z. B. größer für 10 % Suboptimalität).
HINWEIS: Die Einbeziehung suboptimaler Sekundärstrukturen in das Design von MBs ermöglicht die Identifizierung von Regionen innerhalb der Ziel-mRNA, die flexibler oder steifer sein können, als für die Struktur der minimalen freien Energie (MFE) allein vorhergesagt, was das Gesamtdesign von MBs verbessert, die für die Bildgebung lebender Zellen geeignet sind.
- Wählen Sie einen "Sofort-Job" für mRNA-Ziele von 800 Nukleotiden (nt) oder einen "Batch-Job" für mRNA-Längen zwischen 801 und 8.000 nt. Speichern Sie die Datei "ss-count" als einfache Textdatei.
- Verwenden Sie die in Schritt 1.1 erhaltene Datei "ss-count" als Eingabe für das PinMol-Programm (https://bratulab.wordpress.com/software/) mit den gewünschten Parametern, um mehrere MB für das mRNA-Ziel zu entwerfen (siehe Tutorials, die die Verwendung des PinMol-Programms unter https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/ beschreiben ).
- Bestimmen Sie die Spezifität ausgewählter MBs durch Durchführung einer BLAST-Analyse: Verwenden Sie "blastn" mit der entsprechenden Datenbank (z. B. für oskar mRNA-spezifische MB verwenden Sie die Datenbank "refseq-rna" und den Organismus Drosophila melanogaster).
- Identifizieren Sie jede gewebespezifische Expression von mRNA-Zielen (z. B. für oskar mRNA Flybase> Hochdurchsatz-Expressionsdaten> FlyAtlas Anatomy Microarray oder modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) und vergleichen Sie sie mit allen positiven BLAST-Treffern. Eliminierung von Sonden, die eine Kreuzhomologie von >50 % mit anderen mRNAs aufweisen, die ebenfalls in dem interessierenden Gewebe/der interessierenden Zelle exprimiert werden.
- Wählen Sie das Fluorophor-Quencher-Paar aus, das für die für die Bildgebung lebender Zellen verfügbare Mikroskopie-Setup geeignet ist (z. B. Cy5/BHQ2).
2. MB Synthese, Reinigung und Charakterisierung
- Verwenden Sie die hauseigene Synthese und Reinigung, wie zuvor in Bratu, Methods in Molecular Biology (2006) beschrieben, oder Dienstleistungen von kommerziellen Anbietern, um ein bis fünf MB zu synthetisieren und zu reinigen (siehe obige Anmerkung), unter Verwendung des folgenden Markierungsschemas: [5'(Fluorophor)-(C3- oder C6-Linker)-(2'-O-methyl MB-Sequenz)-(Quencher)3']. Reinigen Sie MBs mit Umkehrphasen-HPLC, im eigenen Haus oder über die Dienste des kommerziellen Anbieters.
HINWEIS: Die Phosphoramidite, die für die automatisierte Sondensynthese verwendet werden, müssen die 2'-O-Methyl-Ribonukleotidmodifikation aufweisen. Man kann auch Chimären aus alternierenden Modifikationen von gesperrter Nukleinsäure (LNA) und 2'-O-Methyl verwenden, um die Stabilität eines Hybrids zwischen einer kürzeren MB und ihrer Ziel-mRNA zu erhöhen.
- Synthetisieren von DNA-Oligonukleotiden, die mit der Sequenz der Ziel-RNA-Region übereinstimmen und somit komplementär zur Sondenregion von MB sind, für die Verwendung in der In-vitro-Charakterisierung (siehe Schritte 2.3 bis 2.5; obige Anmerkung). Maximierung der Hybridisierung des MB mit der DNA-Oligonukleotid-Zielnachahmer, indem an jedem Ende des DNA-Ziels vier zusätzliche Nukleotide eingeschlossen werden, wie sie in der Ziel-mRNA-Sequenz vorkommen.
HINWEIS: Eine strengere Charakterisierung der Effizienz des MB beim Nachweis der Zielsequenz kann unter Verwendung von in vitro synthetisierten RNA-Zielen anstelle von komplementären DNA-Oligonukleotiden durchgeführt werden.
- Führen Sie eine thermische Denaturierung des MB allein durch, messen Sie seine Schmelztemperatur (Tm) und bestätigen Sie, dass das MB bei physiologischer Temperatur die gewünschte Haarnadelform annimmt. Wir haben Tum-Werte zwischen 60 und 90 °C beobachtet.
- Führen Sie eine thermische Denaturierung des MB in Gegenwart des DNA-Oligonukleotidziels durch und messen Sie das Tm des MB:DNA-Zielhybriden, wie zuvor in Bratu, Methods in Molecular Biology (2006) beschrieben. Für den MB:DNA-Hybrid ist eine Tm zwischen 55 und 60 °C erwünscht.
- Führen Sie in vitro Hybridisierungsreaktionen mit dem entsprechenden DNA-Oligonukleotidziel durch und bestimmen Sie die Effizienz der MB:DNA-Hybridbildung bei physiologischer Temperatur, wie zuvor in Bratu, Methods in Molecular Biology (2006) beschrieben. Eine schnelle Hybridisierungskinetik mit der DNA-Zielnachahmung ist erwünscht, jedoch können MBs, die keine hohe Hybridisierungseffizienz mit DNA-Zielen zeigen, in vitro und/oder in vivo eine bessere Leistung mit der Ziel-mRNA aufweisen.
3. Dissektion und Vorbereitung einzelner Eikammern für die Mikroinjektion
- Füttern Sie frisch geschlüpfte, verpaarte Weibchen 2-3 Tage lang mit frischer Hefepaste.
- Betäuben Sie die Fliegen auf einem CO2 -Pad und geben Sie mit einer feinen Pinzette (Dumont #5) 1-2 Weibchen in einen Tropfen Halocarbon Öl 700 auf einem Glasdeckglas.
- Richte die Fliege mit einer Pinzette mit der Rückenseite nach oben unter einem Stereomikroskop aus. Präparieren Sie den weiblichen Bauch, indem Sie einen kleinen Schnitt am hinteren Ende machen und drücken Sie das Paar Eierstöcke vorsichtig in das Öl.
- Explantieren Sie die Eierstöcke auf einen Öltropfen auf einem neuen Deckglas. Halten Sie vorsichtig einen Eierstock mit einer Pinzette, während Sie mit der anderen Pinzette die jüngsten Stadien der Eierstöcke abkneifen. Oskar-mRNA ist aktiv in und nach der mittleren Oogenese lokalisiert (Stadien > 7), und jüngere Eikammern (Stadien < 7) sind schwieriger zu injizieren und überleben nicht so lange. Ziehen Sie langsam auf dem Deckglas (mit einer Bewegung nach unten), bis einzelne Eierstöcke oder Eikammern isoliert und vertikal ausgerichtet sind. Trennen Sie die einzelnen Eikammern weiter, indem Sie die unerwünschten Stadien aus der Eierkette der Eierstöcke verdrängen.
HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die einzeln toupierten Eierkammern nicht im Öl schwimmen und auf dem Deckglas haften. Dies ist sowohl für eine erfolgreiche Mikroinjektion als auch für die Bildaufnahme wichtig.
4. Mikroinjektion von MBs in die Ammenzellen der Eikammern
- Bereiten Sie die MB-Lösung mit einem molekularen Beacon (z. B. osk2216Cy5) oder einer Mischung aus zwei MBs her, die auf unterschiedliche mRNAs abzielen und mit spektral unterschiedlichen Fluorophoren markiert sind (z. B. osk2216Cy5 und drongo1111Cy3). Verwenden Sie eine Konzentration von 200-300 ng/μl pro MB in HybBuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7,5, 1,5 mM MgCl2 und 100 mM NaCl). Für einen Cocktail aus vier MBs, die mit demselben Fluorophor markiert sind und auf dieselbe mRNA mit jeweils 200 ng/μl in HybBuffer abzielen (z. B. osk82, osk1236, osk2216). Schleudern Sie die MB-Lösung unmittelbar vor dem Laden der Nadel für die Mikroinjektion herunter.
- Wählen Sie das Ziel aus. Ein 40-faches Ölobjektiv wird empfohlen, um eine geeignete Eikammer zu finden und Mikroinjektionen durchzuführen.
- Montieren Sie das Deckglas mit der präparierten Eikammer auf dem Mikroskoptisch. Bringen Sie das Objektiv in die Fokusposition und identifizieren Sie eine Eikammer in einem mittleren bis späten Entwicklungsstadium, die für die Mikroinjektion richtig ausgerichtet ist (d. h. mit der AàP-Achse senkrecht zur Nadelspitze, um eine einfache Injektion in eine Ammenzelle proximal der Eizelle zu ermöglichen).
- Laden Sie eine Nadel (kommerziell oder im Haus hergestellt) mit ~1 μL MB Lösung (siehe Schritt 1.1) und schließen Sie sie an den Mikroinjektor an. Bei Mikroinjektionen in die Eikammern von D. melanogaster ist die Nadel (siehe Materialtabelle) in einem Winkel von <45° zum Mikroskoptisch (z. B. 30°) auszurichten, um eine Punktion mehrerer Ammenzellen zu vermeiden.
- Stellen Sie den Injektor mit einem Einspritzdruck von 500-1.000 hPa und einem Ausgleichsdruck von 100-250 hPa ein (siehe Werkstofftabelle).
- Bewegen Sie die Bühne langsam, um einen Bereich des Öltropfens ohne Eierkammern in das Sichtfeld zu bringen.
- Senken Sie die Nadel mit dem Joystick des Mikromanipulators vorsichtig in den Öltropfen und richten Sie die Spitze in Richtung des Randes des Sichtfelds in den Fokus.
- Führen Sie eine "Reinigungsfunktion" aus, um die Luft von der Nadelspitze zu entfernen und sicherzustellen, dass die Nadel strömt.
- Bringen Sie die Nadel in die Ausgangsposition und fokussieren Sie sich auf die Eikammer, die mikroinjiziert werden soll, bringen Sie die Nadel dann wieder in den Fokus und positionieren Sie sie in der Nähe des Randes der Eikammer.
- Führen Sie eine Feineinstellung der Z-Position des Objektivs durch, so dass die Membran, die die Follikelzellen von den Ammenzellen trennt, scharf ist.
- Führen Sie die Nadel in eine Schwesterzelle ein und führen Sie die Injektion für 2-5 s durch.
- Entfernen Sie vorsichtig die Nadel und ziehen Sie sie in die Ausgangsposition zurück.
- Ändern Sie das Objektiv auf die gewünschte Vergrößerung für die Bildaufnahme (60-63x oder 100x), fokussieren Sie auf die Eikammer und beginnen Sie mit der Aufnahme.