Screening auf genomische Modifikationen: Eine Methode zur Identifizierung von CRISPR-generierten Mutanten in Drosophila

Abstract

Quelle: Du, L., et al. Eine effiziente Strategie zur Generierung gewebespezifischer binärer Transkriptionssysteme in Drosophila durch Genomeditierung. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video beschreibt eine Screening-Methode zur Identifizierung transgener Drosophila-Fliegen, deren Genom mit CRISPR-Cas9 modifiziert wurde. CRISPR-Cas9 ist ein leistungsstarkes Genom-Editing-Tool, das die Art und Weise, wie Wissenschaftler das Genom eines Organismus manipulieren können, revolutioniert hat. Im Beispielprotokoll werden wir sehen, wie CRISPR-generierte Mutanten identifiziert werden können, bei denen eine Insertion einer Transaktivierungssequenz das erste Exon des verzweigungslosen (bnl) Gens ersetzt und so eine bnl-Gen-spezifische Treiberlinie, bnl-LexA, entsteht.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Du et al., An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing, J. Vis. Exp. (2018).

1. Fliegengenetik und Screening (Abbildung 1 und Abbildung 2)

1. Wenn sich die injizierten Embryonen zu erwachsenen Embryonen entwickeln, kreuzen Sie jede einzelne G₀ Fliegen mit Balancierfliegen. Wählen Sie den geeigneten Balancer für das Chromosom aus, das das Zielallel enthält.
2. Betäuben Sie die F1-Nachkommen aus jeder G0-Kreuzung auf einem CO₂ -Pad und wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 10-20 Männchen unter einem Stereomikroskop aus. Kreuzen Sie sie einzeln mit den Balancer-Weibchen, wie in Abbildung 2 gezeigt.
3. Wenn die F2-Larven schlüpfen, wählen Sie den einzelnen F1-Vater aus jeder Kreuzung aus und extrahieren Sie gDNA unter Verwendung des genomischen DNA-Vorbereitungsprotokolls für eine einzelne Fliege:
   1. gDNA-Extraktionspuffer vorbereiten: 10 mM Tris-Cl pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, bei Raumtemperatur lagern. Bereiten Sie 20 mg/ml Proteinase K-Stammlösung vor und lagern Sie sie im Gefrierschrank.
   2. Legen Sie jede Fliege in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und beschriften Sie das Röhrchen. Über Nacht im -80 °C warmen Gefrierschrank aufbewahren.
   3. Bereiten Sie ein frisches Arbeitsvolumen des gDNA-Extraktionspuffers vor, das eine Endkonzentration von 200 μg/ml Proteinase K.
      Hinweis: Verwenden Sie für diesen Schritt keinen alten Puffer
   .
   4. Zerquetschen Sie jede Fliege 10–15 s lang mit einer Pipettenspitze, die 50 μl Quetschpuffer enthält, ohne die Flüssigkeit abzugeben. Den restlichen Puffer in die Tube geben und gut mischen. Bei 37 °C 20–30 min inkubieren.
   5. Legen Sie die Röhrchen für 1–2 Minuten in einen 95 °C heißen Block, um die Proteinase K zu inaktivieren.
   6. 5 Minuten lang bei 10.000 x g drehen. Lagern Sie das Präparat bei 4 °C für die weitere PCR-Analyse.
4. Verwenden Sie die gleiche Methode, um gDNA aus einer nos-Cas9-Fliege herzustellen, die als Negativkontrolle dient. Führen Sie dreistufige PCR-basierte Screenings durch, um das korrekte HDR zu identifizieren (Abbildung 1, Abbildung 3) unter Verwendung der gDNA jedes F1-Mannes als Vorlage⁵. Verwenden Sie 1 μL des DNA-Prep in folgendem PCR-Reaktionssystem: 10 μL 2x PCR Master Mix mit Farbstoff, 1 μL von jedem Primer (10 μM), 1 μL DNA-Template und 7 μL ddH₂O.
5. Wie in Abbildung 3A gezeigt, führen Sie eine PCR mit den Primern fwd1 und rev1 durch, um das Vorhandensein der Insertion oder des Ersatzes zu überprüfen; führen Sie eine PCR mit fwd2- und rev2-Primern durch, um die Insertion oder den Ersatz aus der 3'-Region zu überprüfen; führen Sie eine PCR mit den Primern M13F und rev3 durch, um das "Ends-in" HDR zu überprüfen (Tabelle 1C).
6. Behalten Sie die Fliegenschnüre mit dem bestätigten Ends-Out-HDR bei und etablieren Sie ausgewogene Schäfte aus der F2-Generation. Die Auskreuzung zum Balancer fliegt erneut, um unbeabsichtigte Mutationen auf anderen Chromosomen zu entfernen.

Results

Abbildung 1: Ein Überblick über den Arbeitsablauf für die CRISPR/Cas9-vermittelte Genomeditierung zur Generierung eines binären Transkriptionssystems. Die ungefähre Zeitdauer, die für jeden Schritt erforderlich ist, wird angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	Sigma Aldrich	Nr. T3253	Molekularbiologie
Edta	Sigma Aldrich	Nr. E1161	Molekularbiologie
NaCl	Sigma Aldrich	Nr. S7653	Molekularbiologie
Ultrareines DNase/RNase-freies Wasser	ThermoFisher Scientific	Tel.: 10977-023	Molekularbiologie
Zündkapseln	IDT-DNA		PCR (Englisch)
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molekularbiologie
2x PCR PreMix, mit Farbstoff (rot)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molekularbiologie
MKRS/TB6B	Labor Kornberg		Fliegen-Schnur
CO2-Station	Genesee Scientific	59-122WCU	Fliegen schieben
Stereomikroskop	Olymp	SZ-61	Fliegen schieben
Homogenisieren von Mikroröhrchen	Fischer-Wissenschaftlich	Tel.: 03-421-217	Isolierung genomischer DNA