Screening auf genomische Modifikationen: Eine Methode zur Identifizierung von CRISPR-generierten Mutanten in Drosophila

Abstract

Quelle: Du, L., et al. Eine effiziente Strategie zur Generierung gewebespezifischer binärer Transkriptionssysteme in Drosophila durch Genomeditierung. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video beschreibt eine Screening-Methode zur Identifizierung transgener Drosophila-Fliegen, deren Genom mit CRISPR-Cas9 modifiziert wurde. CRISPR-Cas9 ist ein leistungsstarkes Genom-Editing-Tool, das die Art und Weise, wie Wissenschaftler das Genom eines Organismus manipulieren können, revolutioniert hat. Im Beispielprotokoll werden wir sehen, wie CRISPR-generierte Mutanten identifiziert werden können, bei denen eine Insertion einer Transaktivierungssequenz das erste Exon des verzweigungslosen (bnl) Gens ersetzt und so eine bnl-Gen-spezifische Treiberlinie, bnl-LexA, entsteht.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Du et al., An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing, J. Vis. Exp. (2018).

1. Fliegengenetik und Screening (Abbildung 1 und Abbildung 2)

1. Wenn sich die injizierten Embryonen zu erwachsenen Embryonen entwickeln, kreuzen Sie jede einzelne G₀ Fliegen mit Balancierfliegen. Wählen Sie den geeigneten Balancer für das Chromosom aus, das das Zielallel enthält.
2. Betäuben Sie die F1-Nachkommen aus jeder G0-Kreuzung auf einem CO₂ -Pad und wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 10-2....

Results

Abbildung 1: Ein Überblick über den Arbeitsablauf für die CRISPR/Cas9-vermittelte Genomeditierung zur Generierung eines binären Transkriptionssystems. Die ungefähre Zeitdauer, die für jeden Schritt erforderlich ist, wird angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	Sigma Aldrich	Nr. T3253	Molekularbiologie
Edta	Sigma Aldrich	Nr. E1161	Molekularbiologie
NaCl	Sigma Aldrich	Nr. S7653	Molekularbiologie
Ultrareines DNase/RNase-freies Wasser	ThermoFisher Scientific	Tel.: 10977-023	Molekularbiologie
Zündkapseln	IDT-DNA		PCR (Englisch)
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molekularbiologie
2x PCR PreMix, mit Farbstoff (rot)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molekularbiologie
MKRS/TB6B	Labor Kornberg		Fliegen-Schnur
CO2-Station	Genesee Scientific	59-122WCU	Fliegen schieben
Stereomikroskop	Olymp	SZ-61	Fliegen schieben
Homogenisieren von Mikroröhrchen	Fischer-Wissenschaftlich	Tel.: 03-421-217	Isolierung genomischer DNA