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Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Koon et al., Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (REM), J. Vis. exp.(2019).
1. Vorbereitung und Fixierung
- Bereiten Sie Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) vor.
- Betäuben Sie erwachsene Fliegen mit 100% Kohlendioxid. Legen Sie anästhesierte Erwachsene (etwa 10 bis 30 Fliegen) in ein kleines Plastikfläschchen mit Schraubverschluss oder ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
- Tauchen Sie betäubte Fliegen 2 h (oder über Nacht) bei 4 °C in 1 ml Fixiermittel (1,25 % Glutaraldehyd, 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,2). Wenn die Fliegen an der Oberfläche des Fixiermittels schwimmen, fügen Sie einige Tropfen 2,5 % Polyethylenglykol-tert-octylphenylether hinzu, um die Oberflächenspannung des Fixiermittels zu schwächen und ein vollständiges Eintauchen des Gewebes zu ermöglichen. Entfernen Sie das Fixiermittel mit einer Glaspipette.
2. Waschen und Dehydrieren
- Waschen und dehydrieren Sie Drosophila melanogaster (Fruchtfliege).
- Waschen Sie die fixierte Probe dreimal mit 1 mL 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,2 bei Raumtemperatur für 10 min in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Entfernen Sie jede Wäsche mit einer Glaspipette und achten Sie darauf, die Fliegen nicht zu entfernen.
- Die Probe wird mit einer abgestuften Ethanolreihe 10 Minuten lang in einem Volumen von 1 ml in einem Mikrofugenröhrchen dehydriert. Die Ethanolkonzentrationen betragen: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Entfernen Sie das Ethanol mit einer Glaspipette und achten Sie darauf, die Fliegen nicht zu entfernen.
- Bewahren Sie die Probe im 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit gerade so viel 100 % Ethanol auf, dass die Probe vor dem Trocknen bedeckt ist.
3. Trocknen
- Führen Sie eine chemische Trocknung mit Hexamethyldisilazan (HMDS) durch.
- Ersetzen Sie die 100%ige Ethanollösung für 20 min durch eine 1:2-Lösung aus HMDS und 100 % Ethanol. Ersetzen Sie die 1:2-Lösung durch eine 2:1-Lösung aus HMDS und 100 % Ethanol für 20 min. Ersetzen Sie die 2:1-Lösung für 20 min durch 100 % HMDS. Wiederholen Sie den Vorgang einmal.
Hinweis: HMDS ist brennbar und ein akutes Toxin (dermaler Weg). HMDS sollte in einem chemischen Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhen, Laborkittel und Augenschutz gehandhabt werden.
- Übertragen Sie die Probe in einem HMDS, wenn sie sich in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen befindet, in eine Einweg-Aluminium-Wiegeschale. Sobald Sie sich in der Aluminium-Waagschale befinden, ersetzen Sie das 100 % HMDS durch gerade genug frisches 100 % HMDS, um die Probe abzudecken.
- Die Probe wird in einen Nichtvakuum-Exsikkator aus Kunststoff oder Glas mit frischem Trockenmittel (5-6 cm tief) gegeben und in einen chemischen Abzug gegeben. Alternativ können Sie die Probe zum Trocknen direkt in einen chemischen Abzug mit einem losen Deckel, z. B. einer Box, legen, um zu verhindern, dass Schmutz auf die Probe fällt. Lassen Sie die Probe 12 bis 24 Stunden trocknen.
4. Montage
- Mount Drosophila melanogaster (Fruchtfliege).
- Beschriften Sie die Unterseite des Aluminium-Montagestummels, um anzugeben, was darauf platziert wird.
Legen Sie die getrockneten Fliegen in die gewünschte Position auf eine Klebe- oder Carbonklebelasche, die mit einer Präzisionspinzette an der Oberseite eines Stummels befestigt ist, unter einem Präpariermikroskop .
- Tragen Sie silbernen leitfähigen Klebstoff, d. h. Silberfarbe, um die Außenkanten der Stummel auf. Verbinde die silberne Farbe mit einem Zahnstocher mit den Fliegen, um die Leitfähigkeit zu gewährleisten. Lassen Sie die Farbe nicht den gewünschten Bildbereich berühren.
- Legen Sie die Stummel in eine Stummelhalterbox und stellen Sie die offene Stummelhalterbox in einen Exsikkator. Lassen Sie die silberne Farbe mindestens 3 Stunden oder über Nacht trocknen, um beste Ergebnisse zu erzielen.