Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Sunderhaus und Kretzschmar, Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
1. Befestigen des Kopfes an Kragen und Einbetten in Paraffin
HINWEIS: Alle Schritte des Fixierungsprozesses sollten in einem Abzug durchgeführt werden. Methylbenzoat stellt zwar kein Gesundheitsrisiko dar, hat aber einen sehr ausgeprägten Geruch, der überwältigend sein kann, wenn es nicht in einem Abzug gehandhabt wird.
- Bevor Sie die Fliegen betäuben, stellen Sie 50 ml Carnoy-Lösung her, indem Sie 15 ml Chloroform und 5 ml Eisessig zu 30 ml 99%igem Ethanol hinzufügen (Chloroform und Essigsäure nicht mischen). Gießen Sie es in einen Glasbehälter mit flachem Boden, z. B. eine Kristallisationsschale, um sicherzustellen, dass die Manschetten flach aufliegen können und vollständig von der Lösung bedeckt sind.
- Betäuben Sie die Fliegen mit CO2 oder Äther.
- Der Faden fliegt (bei den meisten Halsbändern bis zu 20) am Hals mit einer Pinzette in die Halsbänder. Denken Sie daran, alle Köpfe in der gleichen Ausrichtung auszurichten, wie in Abbildung 1 A zu sehen, und seien Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass der Kopf oder die Augen nicht beschädigt werden.
- Fügen Sie Sinus-Oculis-Fliegen (Pfeile, Abbildung 1A) an zufälligen Positionen ein, damit die Reihenfolge der Fliegen in den Abschnitten leicht erkennbar ist. Wenn die Versuchsfliegen eine helle oder weiße Augenfarbe haben, fädeln Sie außerdem einige Rotaugenfliegen, wie z. B. Wildtyp, zwischen sie ein, um sicherzustellen, dass genügend Pigment vorhanden ist, um den Objektträger zu färben. Notieren Sie die Reihenfolge der Fliegen auf einem Protokollblatt zusammen mit der Halsbandnummer, wenn Sie mehr als ein Halsband verwenden.
- Sobald ein Halsband fertig ist, legen Sie es für 3,5 - 4 h in die vorbereitete Carnoy-Lösung.
- Kippen Sie die Carnoy-Lösung in den entsprechenden Entsorgungsbehälter und beginnen Sie mit dem Waschen von Ethanol. Achten Sie darauf, langsam zu gießen, um die Platzierung der Manschetten im Behälter nicht zu stören.
- Waschen Sie die Halsbänder 30 Minuten lang zweimal in 99% Ethanol.
- Waschen Sie die Halsbänder 1 h lang in 100% Ethanol. Achten Sie darauf, die Wäschen rechtzeitig zu wechseln, um eine Überdehydrierung zu vermeiden.
- Legen Sie die Manschetten in Methylbenzoat O/N bei RT. Verschließen Sie den Behälter mit Parafilm, um die Verdunstung des Methylbenzoats zu verhindern.
- Gießen Sie das Methylbenozat in den entsprechenden Einwegbehälter im Abzug. Eine zuvor vorbereitete Mischung aus Paraffinwachs (56 - 57 °C) 1:1 mit niedrigem Schmelzpunkt (56 - 57 °C) wird zugegeben. Ab diesem Zeitpunkt müssen die Manschetten in einem Inkubator bei 65 °C aufbewahrt werden, um sicherzustellen, dass das Paraffin nicht aushärtet.
- Gießen Sie die Mischung aus Methylbenozat und Paraffin in den entsprechenden Einwegbehälter und gießen Sie geschmolzenes reines Paraffinwachs, das bei 65 °C aufbewahrt wird, auf die Halsbänder.
- Wechseln Sie das Paraffin nach 30 min und wiederholen Sie dies mindestens 5 Mal. Es sollten mindestens 6 - 8 Wäschen durchgeführt werden.
- Sobald die Wäschen abgeschlossen sind, legen Sie die Manschetten in eine Gummi-Eiswürfelschale mit Schlitzen, die ungefähr so groß sind wie die Halsbänder. Gießen Sie geschmolzenes Paraffin darüber, bis sie vollständig bedeckt sind, und lassen Sie es O/N aushärten (versuchen Sie, Luftblasen zu vermeiden).
- Entfernen Sie die Paraffinblöcke mit den Manschetten aus der Eiswürfelschale. Trennen Sie den Paraffinblock mit einer Rasierklinge vom Halsband und brechen Sie den Kragen vorsichtig ab. Die Köpfe befinden sich im Paraffinblock, während die Körper im Kragen bleiben. Die Blöcke können bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.
- Um die Halsbänder zu reinigen, weichen Sie sie in einem Entparafinisierungsmittel bei 65 °C ein, um das Paraffin zu entfernen, reinigen Sie sie mit leichtem Schrubben und waschen Sie sie vor der Wiederverwendung in Ethanol.
