Injektion von adulten Drosophila-Fliegen: Eine Methode der Verabreichung von Verbindungen oder Etiketten

Zusammenfassung

Quelle: Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. Bewertung der zellulären Immunantwort der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, unter Verwendung eines In-vivo-Phagozytose-Assays. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video beschreibt, wie eine Injektion von lebenden erwachsenen Fliegen durchgeführt wird und enthält ein Beispielprotokoll, in dem markierte Partikel und Trypanblau in den Bauch von Fliegen injiziert werden, um die Phagozytose zu testen.

Protokoll

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Nazario-Toole und Wu, Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an Vivo Phagocytosis Assay, J. Vis. Exp. (2019).

1. Fluorescein-Partikel für die Injektion vorbereiten

1. 10 mg handelsübliche, hitzeabgetötete Bakterienpartikel, die mit Fluorescein markiert sind (siehe Materialtabelle), werden durch Zugabe von 990 μl sterilem 1x PBS und 10 μl 50 mM Natriumazid auf eine Stammkonzentration von 10 mg/ml rekonstituiert. Vortex zum Mischen.
   1. In 8-μl-Einmal-Aliquots in 0,2-ml-Röhrchen aufteilen und in einer dunklen Box bei 4 °C aufbewahren, um die lichtbedingte Empfindlichkeit zu minimieren.
      HINWEIS: Das Konservierungsmittel Natriumazid ist optional und kann weggelassen werden, wenn 10 mg/ml-Brühen mit 1 mL sterilem 1x PBS hergestellt, aliquotiert und bei -20 °C gelagert werden.
2. Stellen Sie eine 10-ml-Lösung aus 5 % Lebensmittelfarbe in 1x PBS her, indem Sie 500 μl spritzengefilterte grüne Lebensmittelfarbe und 9,5 ml sterile 1x PBS mischen.
3. Waschen Sie die Partikel vor der Injektion, um Natriumazid zu entfernen. Mischen Sie 42 μl steril 1x PBS und 8 μl 10 mg/ml in einem 1,7 mL Röhrchen. Zentrifugieren Sie 2,5 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit bei Raumtemperatur.
   1. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 50 μl 1x PBS hinzu und zentrifugieren Sie 2,5 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit bei Raumtemperatur.
   2. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 und 1.3.1 2x für insgesamt 3 Wäschen.
   3. Nach der letzten Wäsche den Überstand entsorgen und die Partikel auf 1,6 mg/ml in 50 μl 5 % Lebensmittelfarbe in 1x PBS resuspendieren.
   4. Wickeln Sie das Rohr zum Schutz vor Licht in Alufolie ein. Bei 4 °C lagern, nach 1 Woche entsorgen.

2. Bereite die Injektionsstation vor und fliege

1. Bereiten Sie das Injektionskissen vor. Um bis zu 4 Genotypen von Fliegen gleichzeitig zu injizieren, verwenden Sie Laborband, um ein rechteckiges CO₂ -Fliegenpad in 4 Abschnitte zu unterteilen. Bestimmen Sie auf der Bank in der Nähe des Mikroskops Bereiche, in denen die Fläschchen platziert werden sollen, sobald die Fliegen auf dem Pad ausgerichtet sind (eine für jede Ecke des Pads).
2. Bereiten Sie Fläschchen mit altersgerechten, 4-7 Tage alten Fliegen für die Injektion vor. Für jeden zu testenden Stamm werden 5 Männchen und 5 Weibchen in ein frisches, beschriftetes Fläschchen mit zubereitetem Fliegenfutter umgefüllt und bei 25 °C aufbewahrt.
3. Bereiten Sie den pneumatischen Injektor vor (siehe Materialtabelle), indem Sie das Gerät auf einen zeitgesteuerten Modus von 100 ms (kurze Gasdruckstöße zum Ausstoßen der Flüssigkeit – ermöglicht die Abgabe von Sub-Nanoliter-Volumina) einstellen.
4. Bereiten Sie die Objektträger vor. Schneiden Sie 1,5-Zoll-Streifen Isolierband ab, falten Sie sie mit der Klebeseite nach außen zu einer Schlaufe und legen Sie sie auf einen beschrifteten Objektträger.

3. Glaskapillarnadeln vorbereiten

1. Ziehen Sie Glasnadeln (dünnwandige Glaskapillaren) mit einem Nadelabzieher.
   1. Halten Sie die Nadel mit einem Mikrometer unter das Mikroskop und brechen Sie die Spitze mit einer Pinzette #5 aus Edelstahl mit feiner Spitze. 100 μm Spitzen reichen aus, um die Nagelhaut der Fliege zu durchstechen und gleichzeitig Wunden zu minimieren.
   2. Messen Sie das Volumen der Flüssigkeit, die in jede Fliege injiziert wird. Füllen Sie die Nadel mit steriler 5%iger Lebensmittelfarbe in 1x PBS und stoßen Sie die Flüssigkeit auf einen Tropfen Mineralöl auf einem 0,01 mm Tischmikrometer aus.
      HINWEIS: Ist der Flüssigkeitstropfen kugelförmig, wird das Volumen in Pikolitern als (Größe)³/1910 berechnet. Eine Nadel mit einem Durchmesser von 100 μm wirft ~2 nL in 100 ms aus.

4. Fliegen injizieren

1. Pipettieren Sie 10 μl 1,6 mg/ml-Partikel auf ein kleines Quadrat Parafilm.
   1. Ziehen Sie die Flüssigkeit in die Nadel und montieren Sie sie in die Einspritzdüse (siehe Materialtabelle).
   2. Betäuben Sie die Fliegen mit CO₂ und richten Sie sie in dem dafür vorgesehenen Bereich auf dem Flypad aus, mit der Bauchseite nach oben und den Köpfen nach vorne ausgerichtet. Stellen Sie die Fläschchen in die entsprechenden Bereiche auf der Bank.
   3. Injizieren Sie Fliegen in der oberen Ecke des Bauches mit 5.100 ms Pumpstößen Flüssigkeit (~10 nL insgesamt).
   4. Übertragen Sie die injizierten Fliegen in die entsprechenden Durchstechflaschen, notieren Sie die Uhrzeit auf der Durchstechflasche. Bei 25 °C halten.
2. Laden Sie eine neue Nadel mit 0,4 % Trypanblau-Lösung.
3. Stellen Sie den pneumatischen Injektor auf GATED, was einen konstanten Luftstrom ermöglicht, um die Flüssigkeit aus der Nadel zu drücken.
4. Betäuben Sie die Fliegen, nachdem sie 30 Minuten geruht haben, und injizieren Sie Trypanblau, bis der Bauch voll und aufgebläht ist.
   HINWEIS: Wenn Sie die Phagosomenreifung mit Partikeln untersuchen, die mit einem pH-empfindlichen Farbstoff markiert sind, lassen Sie die Fliegen 1 h ruhen und injizieren Sie kein Trypanblau, bevor Sie Fliegen montieren.
5. Montieren Sie Fliegen mit Isolierband mit der Bauchseite nach unten auf Objektträger. Schiebe die Flügel an die Seite des Hosenschlitzes und befestige sie am Band. Schieben Sie den Kopf vorsichtig in das Klebeband, um sicherzustellen, dass sich die Fliege nicht bewegt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5430-10 PicoNozzle Kit	Welt Präzisionsinstrumente	5430-10	Halter für 1,0mm Pipette
E. coli (K-12 Stamm) BioPartikel, Fluorescein-Konjugat	Invitrogen	E2861	Abgetötete E. coli, markiert mit FITC (Fluorescein). Zur Testung der Phagozytenerkennung und der Aufnahme gramnegativer Bakterien. (~494/~518 nm)
Nadel-Pipettenabzieher	David Kopf Instruments	Modell 725
Pneumatische PicoPump PV820	Welt Präzisionsinstrumente	SYS-PV820	Die pneumatische PicoPump PV820 von World Precision Instruments verwendet Differenzdrücke, um Flüssigkeit zwischen den Injektionen in der Glasnadel zu halten. Der Benutzer steuert manuell kurze Gasdruckstöße, um die Flüssigkeit auszustoßen – so können Volumina im Sub-Nanoliter-Bereich abgegeben werden. Die Menge der geförderten Flüssigkeit hängt von zwei Hauptvariablen ab – der Größe der Glasnadelöffnung und der Zeit, in der der Injektionsdruck ausgeübt wird. Stellen Sie das Gerät auf 100 ms "TIMED"-Modus.
Dünnwandige Glaskapillaren	Welt Präzisionsinstrumente	TW100F-3	Nadeln für die Injektion. AD = 1,0 mm
Trypanblaue Lösung (0.4%)	Sigma	T8154	Wird verwendet, um die extrazelluläre Fluoreszenz von Fluorescein-, Alexa Fluor- oder Texas Red-markierten Partikeln zu löschen.