Geschmackspräferenz-Assay: Eine Methode zur Messung des Fressverhaltens bei Drosophila

Abstract

Quelle: Bantel, A. P. und Tessier, C. R. Geschmackspräferenz-Assay für adulte Drosophila. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video beschreibt den Geschmackspräferenz-Assay, eine Verhaltensmethode, die verwendet wird, um die Anziehungskraft oder Vermeidung von farbigen Lösungen, die anders schmecken, zu messen, indem die Bauchfärbung der Fliege nach der Einnahme der bevorzugten Substanz bewertet wird. Das vorgestellte Protokoll demonstriert das Verfahren, mit dem die Präferenz von Fliegen für Lösungen mit unterschiedlichen Saccharosekonzentrationen gemessen wird.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Bantel und Tessier, Taste Preference Assay for Adult Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).

1. Hunger

1. Bereiten Sie Fläschchen gegen Fliegenhunger vor, indem Sie einen Wattebausch mit 18,2 MΩ Wasser auf dem Boden eines Standard-Fläschchens tränken. Alternativ können Sie auf ähnliche Weise einen kleinen Streifen Filterpapier mit 18,2 MΩ Wasser tränken und schräg in das Fläschchen legen.
2. Sammeln Sie die Fliegen in Sets von ~100 Tieren auf einem CO₂ -Pad und geben Sie die Fliegen dann in ein vorbereitetes Fläschchen.
   HINWEIS: Die besten Ergebnisse werden mit Tieren erzielt, die weniger als 5 Tage alt sind. Das genaue Alter der Tiere kann jedoch als experimentelle Variable gesteuert werden, um Veränderungen der Geschmackspräferenzen im Laufe der Zeit zu bestimmen.
3. Verwenden Sie einen Wattebausch oder einen Schaumstoffstopfen, um die Fläschchen geschlossen zu halten. Legen Sie die Fläschchen auf die Seite in einen umweltkontrollierten Inkubator. Halten Sie die Temperatur bei 25 °C und die Luftfeuchtigkeit über 70 %. Lassen Sie die Fläschchen 24 Stunden lang unberührt.

2. Geschmackspräferenz-Assay

1. Bereiten Sie alle Geschmacksstoffe für den Test am selben Tag vor, an dem der Test durchgeführt wird.
   HINWEIS: Die genauen Geschmackstoffe, die verwendet werden, variieren je nach experimenteller Fragestellung. Im Folgenden finden Sie Beispiele für Tasterants, die in diesem Protokoll verwendet werden. Siehe Abschnitt 4 für Optimierungen.
   1. Bereiten Sie das Kontrollschmackmittel (1 mM Saccharose) zu, indem Sie 10 μl 100 mM Saccharoselösung, 13 μl rote Lebensmittelfarbe und 977 μl 18,2 MΩ Wasser mischen.
   2. Bereiten Sie experimentelles Geschmacksmittel (5 mM Saccharose) zu, indem Sie 50 μl 100 mM Saccharoselösung, 10 μl blaue Lebensmittelfarbe und 940 μl 18,2 MΩ Wasser mischen.
2. Die Assay-Kammern werden unter Verwendung einer Standard-Petrischale aus 100 mm x 15 mm Kunststoff hergestellt, die auf folgende Weise vorbereitet ist:
   1. Drei 10-μl-Tropfen Kontrollgeschmack am oberen Rand der Platte bei 12 Uhr und weitere 3 Tropfen bei 6 Uhr platzieren. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen den Tropfen ähnlich ist.
   2. Drei 10-μl-Tropfen experimentelles Schmacksmittel werden am oberen Rand der Platte bei 3 Uhr und weitere 3 Tropfen bei 9 Uhr platziert. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen den Tropfen ähnlich ist.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1 und 2.2.2 für beliebig viele Replikate.
3. Leeren Sie 1 Fläschchen mit ~100 verhungerten Fliegen auf ein CO₂ -Pad, gerade lange genug, um alle Tiere zu betäuben (ca. 10 Sekunden). Die Tiere werden in der Mitte einer vorbereiteten Versuchskammer gebürstet und mit dem Schalendeckel abgedeckt.
   HINWEIS: Längere Zeiträume der CO₂ -Exposition sollten vermieden werden, um die Erholungszeit zu verkürzen und eine Beeinträchtigung des Fressverhaltens zu begrenzen. Die Exposition gegenüber Eis (~5 min) kann zur Betäubung verwendet werden, um CO₂ -Verhaltenseffekte zu vermeiden, die selbst bei begrenzter Exposition auftreten können.
4. Stellen Sie die Untersuchungskammer in einen undurchsichtigen Karton. Achten Sie darauf, dass die Außenseite der Verpackung mit der zu testenden Erkrankung und dem Genotyp beschriftet ist.
5. Stellen Sie den gesamten Aufbau (Assay-Kammer in einem Karton aus Schritt 2.4) für 2 Stunden in einen 25 °C heißen Inkubator mit mindestens 70 % Luftfeuchtigkeit
.
6. Wiederholen Sie die Schritte 2.3 bis 2.5 für alle Replikate.
7. Nach 2 Stunden werden die Assay-Kammern, die sich noch in Kartons befinden, direkt in einen -20 °C-Gefrierschrank gestellt, bis sie für die Quantifizierung bereit sind.

3. Quantifizierung von Geschmackspräferenz-Assays

1. Lassen Sie eine einzelne Assay-Kammer auf Raumtemperatur erwärmen (ca. 5 Minuten).
2. Unter einem Präpariermikroskop werden die Tiere mit einem Pinsel oder einer Pinzette nach der Farbe ihres Hinterleibs gruppiert: rot, blau, violett oder klar (Abbildung 1).
3. Notieren Sie die Anzahl der Tiere in jeder Gruppe. Betrachten Sie eindeutige Tiere als nicht an der Prüfung teilgenommen und beziehen Sie sie daher nicht in die Berechnungen ein.
4. Berechnen Sie den Präferenzindex nach einer der folgenden Gleichungen:
   1. Wenn der experimentelle Geschmack von Interesse zum roten Farbstoff hinzugefügt wird, verwenden Sie (N_rot + 0,5N_violett)/(N_rot + N_blau + N_violett).
   2. Wenn der experimentelle Geschmacksstoff zum blauen Farbstoff hinzugefügt wird, passen Sie die Gleichung an (N_Blau + 0,5N_Lila)/(N_Blau + N_Rot + N_Lila).
5. Wiederholen Sie die Berechnungen für alle Versuchsbedingungen und Replikationen.

4. Optimierung des Geschmackspräferenz-Assays

1. Bestimmen Sie empirisch die Konzentration der zu verwendenden Lebensmittelfarbindikatoren, damit die Lebensmittelfarbe das Ergebnis des Geschmackstests nicht beeinflusst, wie folgt:
   1. Bereiten Sie 4 Schmackhaftungsmittel mit der gleichen Grundmasse (z.B. 5 mM Saccharose) wie in Schritt 2.1 angegeben zu, aber lassen Sie die Lebensmittelfarbe weg.
   2. 1,3 % rote Lebensmittelfarbe zu einem der Tastants hinzufügen. Machen Sie die restlichen 3 Schmackhaftigkeiten mit blauer Lebensmittelfarbe in unterschiedlichen Konzentrationen in jeder Tube (z. B. 0,6 %, 1 % und 1,3 %).
   3. Führen Sie die Protokollschritte 2.2 bis 3.4 für jedes Geschmackspaar aus: 1,3 % Rot vs. 0,6 % Blau; 1,3 % Rot vs. 1 % Blau und 1,3 % Rot vs. 1,3 % Blau.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.1-4.1.3 mit unterschiedlichen Prozentsätzen blauer Lebensmittelfarbe, bis der Präferenzindex einen Durchschnittswert von 0 erreicht (Abbildung 2).
      HINWEIS: Als Ausgangspunkt führt eine 1,3 % rote Lebensmittelfarbe in Verbindung mit 1 % blauer Lebensmittelfarbe in der Regel zu guten Ergebnissen. Wenn keine zufriedenstellende Konzentration von blauer Lebensmittelfarbe mit 1,3 % Farbstoff abgeglichen werden kann, können die Schritte 4.1.1 bis 4.1.3 mit unterschiedlichen Konzentrationen von roter Farbe und einer konstanten Konzentration von blauer Lebensmittelfarbe wiederholt werden.
   5. Analysieren Sie alle zu testenden Bedingungen mit den gleichen optimierten Konzentrationen von Lebensmittelfarbstoffen.

Results

Abbildung 1: Ergebnisse des Geschmackspräferenz-Assays. Es werden einige Beispiele in der Variation der Bauchfärbung gezeigt. Dunkelrot verschluckt (A). Hellrot verschluckt (B). Dunkelblau verschluckt (C). Hellblau verschluckt (D). Violette Abdomen werden in Betracht gezogen, wenn die gesamte Färbung violett erscheint (E) oder wenn be...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blaue Lebensmittelfarbe (Wasser, Propylenglykol, FD&C Blau 1 und Rot 40, Propylparaben)	Mccormick	N/A
Kryo-/Gefrierboxen ohne Trennwände	Fischer	Tel.: 03-395-455
Dumont #5 Pinzette	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11251-20
Leica S6 E Stereozoom 0,63X-4,0X Mikroskop	W. Nuhsbaum, Inc.	10446294
Petrischale (100 mm x 15 mm)	BD Falke	351029	Wiederverwendbar, wenn es gründlich gewaschen und getrocknet
Quick-Snap-Mikroröhrchen	Alkali Scientific Inc.	Nr. C3017
Rote Lebensmittelfarbe (Wasser, Propylenglykol, FD&C Rot 40 und 3, Propylparaben)	Mccormick	N/A
Saccharose	IBI Wissenschaftlich	IB37160