Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Diegelmann et al., The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).
1. Assemblierung und Durchführung des CApillary FEeder-Assays
- Wenn das Fasten nicht erforderlich ist, werden die Versuchsfliegen durch Klopfen oder Blasrohr in den Assay überführt. Stellen Sie sicher, dass Sie drei Kontrollfläschchen ohne Fliegen enthalten, um die Verdunstung zu quantifizieren.
- Entfernen Sie vorsichtig eine Pipettenspitze (2 - 20 μl Volumen), die eine der äußeren Öffnungen verschließt, und führen Sie mit dem unteren Ende zuerst eine gefüllte Glaskapillare ein. Sichern Sie die Kapillare, indem Sie die Pipettenspitze wieder in die Nähe der Kapillare legen. Wenn mehrere Lebensmittellösungen getestet werden, wiederholen Sie diesen Vorgang entsprechend.
- Platzieren Sie die Kapillarenden in allen Fläschchen auf gleicher Höhe, um eine Verzerrung zu vermeiden, die auftreten könnte, wenn sich die Nahrungsquellen in unterschiedlichen Höhen (3 - 4 cm vom Deckel entfernt) befinden. Halten Sie Abstand zum Filterpapier, um zu verhindern, dass die Kapillare durch versehentliches Berühren des Filterpapiers oder unterschiedlicher Viskositäten von Nahrungsquellen ausläuft.
- Beschriften Sie das obere Ende der farbigen Flüssigkeit mit einem Filzstift (Anfang markieren). Um sicherzustellen, dass die verschiedenen Kapillaren identifiziert werden können, beschriften Sie sie individuell mit einem Farb- oder Streifencode.
- Legen Sie mehrere vorbereitete CAFE-Assays in eine Kunststoffbox mit Gittereinlage und bringen Sie die Box (Abbildung 2A) für den Versuchszeitraum (z.B. 3 h oder Tage) an einen sicheren Platz unter Laborbedingungen oder in eine temperatur-, licht- und feuchtekontrollierte Klimakammer (Parameter: 25 °C, 60% relative Luftfeuchtigkeit, 12 h/12 h Hell-Dunkel-Zyklus).
- Da das untere Filterpapier austrocknet, wenn der Assay über mehrere Tage durchgeführt wird, tragen Sie alle 24 Stunden frisches Wasser über den Schwammstopfen (100 μl) auf, um die Luftfeuchtigkeit im Assay konstant zu halten. Verwenden Sie vier separate Fläschchen (8 cm Höhe, 3,3 cm Durchmesser), die mit 30 mL ddH2O gefüllt sind, als Feuchtegeräte und platzieren Sie sie neben den CAFE-Assays in der Kunststoffbox. Verwenden Sie eine Abdeckung für die Kunststoffbox, um während des Experiments eine feuchtigkeitskontrollierte Umgebung zu schaffen (Abbildung 2A).
HINWEIS: Eine breitere Variabilität tritt unter Laborbedingungen auf; Es ist jedoch möglich, den CAFE-Assay bei Raumtemperatur (z. B. in einem Klassenzimmer) durchzuführen. Die Verwendung eines Befeuchtungsgeräts (Filterpapier, mit oder ohne nassen Schwammspund, gefüllte Wasserfläschchen und Abdeckung für die Kunststoffbox) wird dringend empfohlen, um die Verdunstung zu verringern (Abbildung 2B).
- Ersetzen Sie die Kapillaren für Langzeitversuche alle 24 Stunden durch frisch gefüllte Kapillaren. Notieren Sie sich die toten Fliegen vor jedem 24-Stunden-Intervall und berechnen Sie anhand der Anzahl der lebenden Fliegen den Verbrauch pro Fliege für den folgenden Zeitraum. Die alten Kapillaren werden nach Messung des Meniskusabfalls verworfen (siehe 2.1).
HINWEIS: Während eines 3-stündigen Experiments sehen wir kaum tote Fliegen. Während einer 4-tägigen Studie finden wir in der Regel 1 - 3 tote Fliegen.
- Markieren Sie am Ende des Assays oder vor dem Austausch der Kapillare den unteren Meniskus der Kapillare (Markierungsende) mit einem Markierungsstift, während sich der CAFE-Assay noch in aufrechter Position befindet. Verwerfen Sie die Daten, wenndas Ende der Markierung nicht unter der ursprünglichen Markierung liegt (Markierungsanfang). Nehmen Sie den Deckel nicht ab, da sich dadurch der Meniskus verändern könnte.
- Entfernen Sie vorsichtig die Kapillaren aus dem Assay und bewahren Sie sie für die Datenerfassung auf. Prüfen Sie, ob die Flüssigkeit in der Kapillare das untere Ende erreicht hat, wenn nicht, verwerfen Sie die Daten, da die Nahrung für die Fliegen nicht zugänglich war. Sammeln Sie alle Kapillaren pro Durchstechflasche als Gruppe. Führen Sie ungeschnittene Pipettenspitzen in alle Öffnungen ein, um ein Entweichen von Fliegen zu verhindern. Demontieren Sie das Setup und waschen Sie die Fläschchen, Deckel und Schwammstopfen in einem Seifenbad und trocknen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur zur weiteren Verwendung.
HINWEIS: Fliegen können nach dem Assay weiter analysiert werden. Bestätigen Sie die Nahrungsaufnahme mit dem Auge oder unter einem Präpariermikroskop.
- Wiederholen Sie Experimente mit denselben Genotypen an mindestens drei verschiedenen Tagen.
2. Datenerfassung und -analyse
- Messen Sie den Abstand zwischenMarkierungsanfang undMarkierungsende auf der Kapillare mit einem Messschieber oder einem Lineal. Um Daten direkt in eine Tabellenkalkulation zu übertragen, verwenden Sie einen über USB (Universal Serial Bus) angeschlossenen digitalen Messschieber (Abbildung 1E). Entsorgen Sie die Kapillaren nach der Messung.
- Berücksichtigen Sie die Kapillargröße, um die Nahrungsaufnahme oder -verdunstung zu berechnen. Stellen Sie sich zum Beispiel eine Kapillare vor, die 73 mm lang ist und 5 μl Lebensmittellösung enthält. Eine Abnahme des Meniskus um 14,6 mm spiegelt die Aufnahme von 1 μl Lösung wider. Berechnen Sie die Nahrungsaufnahme mit der folgenden Formel:
Nahrungsaufnahme (μL) = gemessener Abstand (mm)/ 14,6 mm
- Um die Auswirkungen der Verdunstung auf die Nahrungsaufnahme auszuschließen, berechnen Sie die mittlere Verdunstung in den drei (mindestens) Kontrollfläschchen ohne Fliegen. Subtrahieren Sie diesen Mittelwert von dem Wert, den die Fliegen für die Nahrungsaufnahme erhalten.
- Verwenden Sie die folgende Formel, um den Gesamtverbrauch pro Flug zu bestimmen:
Nahrungsaufnahme (μL) = (Nahrungsaufnahme [μL] - Verdunstungsverlust [μL])/Gesamtzahl der Fliegen in der Durchstechflasche. Für Langzeitexperimente wird die Anzahl der lebenden Fliegen vor Beginn des 24-Stunden-Intervalls verwendet.
- Um Unterschiede in der Körpergröße, z. B. zwischen männlichen und weiblichen Fliegen, auszugleichen, normalisieren Sie die Nahrungsaufnahme auf das Körpergewicht (μl Nahrung/mg Fliege).
- Verwenden Sie Statistiksoftware für die Datenanalyse. Verwenden Sie für normalverteilte Daten die T-Tests der Schüler, um die Unterschiede zwischen zwei Fliegengruppen zu bestimmen, und verwenden Sie die ANOVA (Varianzanalyse) mit Post-hoc-Tukey-Cramer-Tests für mehr als zwei Gruppen. Analysieren Sie in einer Auswahlsituation die Unterschiede zur Zufallsauswahl mit einem nichtparametrischen Vorzeichentest bei einer Stichprobe.
