Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Tenenbaum und Gavis, Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Filllets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells, J. Vis.(2016).
HINWEIS: Das Verfahren zur Muskelentfernung (Abbildung 1) ist eine Modifikation der zuvor beschriebenen Methoden zur Vorbereitung von Larvenfilets. Die Schritte, die der Muskelentfernung vorausgehen und folgen, werden kurz skizziert und der Leser wird auf frühere Arbeiten in Brent et al., J. Vis. Exp. (2009) und Karim und Moore, J. Vis. Exp. (2011) für detailliertere Beschreibungen.
1. Larven in kalter Kochsalzlösung sezieren
- Bereiten Sie eine Arbeitsverdünnung von kalter HL3.1-Kochsalzlösung oder kalter Ca2+-freier HL3.1-Kochsalzlösung vor (Tabelle 1). Legen Sie die Larve in eine Silikonelastomerschale, in der gerade so viel kalte Kochsalzlösung vorhanden ist, dass der Boden der Schale bedeckt ist.
HINWEIS: Wir empfehlen, bei der Larvendissektion mit der Verwendung von Ca2+-freier HL3.1-Kochsalzlösung im Vergleich zu Standard-HL3.1-Kochsalzlösung zu experimentieren. In Abwesenheit von Kalzium sind die Muskelkontraktionen der Larven stark reduziert. Daher können Larvenfilets leichter zu manipulieren sein, wenn sie in Ca2+-freier HL3.1-Kochsalzlösung präpariert werden. Wir stellen jedoch fest, dass die Muskelkontraktion Raum zwischen dem Muskel und der Epidermis schafft, was das Einführen einer Pinzette zwischen diesen Geweben erleichtern und gleichzeitig das Risiko einer Schädigung der Epidermis minimieren kann. Infolgedessen kann das Standard-HL3.1 vorzuziehen sein, um die Integrität der Epidermis und der da-Neuronen zu erhalten. Wir erzielen gute Ergebnisse mit beiden Kochsalzlösungen und die Wahl bleibt dem Benutzer überlassen.
- Positionieren Sie die Larve mit der Bauchseite nach oben. Die ventrale Oberfläche der Larve ist an den abdominalen Zahngürteln und die dorsale Seite an den primären Larventrachealtuben zu erkennen, die von anterior nach posterior verlaufen. Strecken Sie die Larve in anterior-hinterer Richtung und stecken Sie Kopf und Schwanz mit Insektennadeln an eine Präparierschale aus Silikonelastomer. Schneiden Sie mit einer feinen Präparierschere entlang der ventralen Mittellinie, beginnend an einem Ende und fortschreitend zum anderen.
HINWEIS: Diese Orientierung bewahrt den häufig untersuchten dorsalen Cluster von da-Neuronen.
- Nachdem die Larve aufgeschnitten ist, stecken Sie die vier Ecken an die Sezierschale, als ob Sie ein Buch aufschlagen würden. Verwenden Sie eine Pinzette, um innere Organe wie ZNS, Darm und Luftröhre zu greifen und zu entfernen. Stellen Sie die Insektenstifte so ein, dass die Verrundung straff, aber nicht maximal gedehnt wird.
HINWEIS: Die Muskeln sind an den Segmentgrenzen an der Körperwand verankert. Obwohl Muskeln den größten Teil der Körperwand bedecken, fehlen sie in einer schmalen Region in der Nähe der dorsalen Mittellinie.
2. Muskelentfernung
- Lokalisieren Sie die dorsale Mittellinie der Larve, wo Muskelgewebe fehlt. Positionieren Sie eine einzelne Pinzette so, dass sie in möglichst flacher Ausrichtung unter das Muskelgewebe eingeführt werden kann.
- Beginnen Sie an der dorsalen Mittellinie, in der Nähe der vorderen Grenze des Segments, schieben Sie die Zange vorsichtig zwischen Muskel und Epidermis und achten Sie darauf, den Kontakt zwischen Pinzette und Epidermis zu minimieren.
- Ziehe die Pinzette nach oben, um die Befestigung des Muskels an der Körperwand an einem Ankerpunkt zu lösen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für das/die verbleibende(n) Hemi-Segment(e) von Interesse.
HINWEIS: Dieses Protokoll optimiert die Erhaltung des hinteren Dendritenfeldes jedes da-Neurons. Um den vorderen Teil des Dendritenfeldes zu erhalten, ist es am besten, die Zange am hinteren Ende jedes Segments einzuführen.
- Stellen Sie die Insektenstifte so ein, dass das Larvenfilet maximal in alle Richtungen gedehnt wird.
- Fixieren Sie das Filet, während es noch an der Präparierschale befestigt ist, mit kaltem, frisch zubereitetem 4%igem Formaldehyd in PBS für 25 min.
- 5 Mal in PBS spülen.
- Ziehen Sie mit einer Pinzette vorsichtig Muskelgewebe von den verbleibenden Ankerpunkten ab und achten Sie darauf, den Kontakt mit der Epidermis zu minimieren.
- Lösen Sie das Filet aus der Präparierschale und nehmen Sie es in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte zum Waschen, Blockieren und Immunfluoreszenzfärben durch, wie zuvor in Karim und Moore, J. Vis. Exp. (2011).
