Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Reimels und Pfleger, Methoden zur Untersuchung der Lymphdrüse und der Hämozyten in Drosophila-Larven, J. Vis. Exp. (2016).
1. Immunhistochemie der Lymphdrüsenlarve
HINWEIS: Die Lymphdrüse befindet sich etwa eine Drittellänge vom vorderen Ende einer Larve entfernt etwas unterhalb des Gehirns auf der dorsalen Seite. (Siehe Pfeil in Abbildung 1B.) Die Lymphdrüse flankiert das dorsale Gefäß und lässt sich am einfachsten an den Mundhaken oder am Gehirn befestigen. Wildtyp-Lymphdrüsen des dritten Stadiums sind sehr kleine Strukturen; Die Primärlappen sind ca. 100 - 200 μm lang. (Siehe Abbildung 2A.)
- Um Larven mit ungefähr dem gleichen Entwicklungsstadium für diesen Test zu erhalten, beschränken Sie die Eizellentnahme, indem Sie den Weibchen erlauben, Eier für einen festgelegten Zeitraum von 2 - 6 Stunden zu legen.
- Dissektion der Lymphdrüsen
- Für jede Versuchsbedingung 1 ml 1x PBS (Tabelle 1) in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte geben.
- Geben Sie 1 Tropfen 0,1 % PBST (Tabelle 1) mit einer Einweg-Transferpipette in jede Vertiefung.
HINWEIS: Reinigungsmittel, wie z. B. Tween 20, wird hinzugefügt, um die Oberflächenspannung zu senken, so dass das Gewebe auf den Boden der Vertiefung sinken kann.
- Lege den Teller flach auf Eis.
- Sammeln Sie die Larven in Präparierschalen, die mit 1x PBS gefüllt sind.
- Legen Sie ein sauberes Präparierpad auf eine beleuchtete Stereomikroskopbasis. Verwenden Sie eine Einweg-Transferpipette, um kleine Tropfen mit 0,01 % PBST (Tabelle 1) auf das Pad zu geben. Übertragen Sie eine Larve zum Sezieren in einen PBST-Tropfen.
- Halten Sie die Larve mit einer Pinzette etwa eine Viertellänge vom hinteren Ende entfernt, mit der Rückenseite nach oben.
- Verwende eine weitere Pinzette, um die Nagelhaut direkt vor der Pinzette zu greifen, die die Larve hält. Ziehen Sie die Nagelhaut vorsichtig in Richtung des vorderen Endes, bis die Mundhaken freiliegen.
HINWEIS: Ziel ist es, die Nagelhaut zu schälen, ohne die inneren Strukturen zu stören.
- Löse die Nagelhaut und schneide die Larve mit beiden Pinzetten in zwei Teile. Entfernen Sie das hintere Ende aus dem PBST-Tropfen.
HINWEIS: Wenn sich die Nagelhaut nicht bis zu den Mundhaken schält, schneiden Sie die Larve in zwei Hälften und entfernen Sie das hintere Ende. Verwende eine Pinzette, um den Rand der Nagelhaut zu halten, und benutze die andere Pinzette, um die Mundhaken durch die Öffnung zu schieben. Dadurch wird die Nagelhaut umgedreht und die Mundhaken freigelegt. Dies kann auch als alternative Präpariermethode verwendet werden.
- Verwende eine Pinzette, um die Nagelhaut (entweder die ventrale Kutikula, den dorsalen Nagelhautlappen oder beides) festzunageln, um Stabilität zu gewährleisten.
- Greifen Sie mit einer weiteren Pinzette die freiliegenden Mundhaken und ziehen Sie sie vorsichtig heraus.
HINWEIS: Dadurch wird die Nagelhaut von den inneren Strukturen getrennt. Im Idealfall bleiben die Imaginalscheiben des Auges/der Fühler, das Gehirn, die Ringdrüse und die Lymphdrüse, die das dorsale Gefäß flankieren, an den Mundhaken befestigt.
- Während Sie die Mundhaken festhalten, entfernen Sie vorsichtig unerwünschte Strukturen wie die Speicheldrüsen, den Fettkörper und den Darm.
HINWEIS: Wenn sich das Gehirn von den Mundhaken trennt, kann die Lymphdrüse immer noch mit dem Gehirn verbunden sein und mit ihm gesammelt werden. Halten Sie in diesem Fall den ventralen Nervenstrang anstelle der Mundhaken.
- Mit den Mundhaken oder dem ventralen Nervenstrang als Griff wird der präparierte Komplex mit der Lymphdrüse in die Vertiefung auf Eis übertragen. Nicht länger als 30 Minuten vor der Fixierung.
- Fixation und Immunhistochemie
- Setzen Sie die 24-Well-Platte auf die Stereomikroskopbasis.
- Verwenden Sie eine p200-Pipette, um das PBST vorsichtig aus der Vertiefung zu entfernen.
HINWEIS: Leere, benachbarte Brunnen sind nützlich, um Abfälle vorübergehend abzulagern.
- Geben Sie vorsichtig 200 μl 3,7 % Formaldehyd (Tabelle 1) an der Seite der Vertiefung hinunter und schwenken Sie die Platte, um sicherzustellen, dass das präparierte Gewebe vollständig untergetaucht ist.
- Den Teller wieder 30 Minuten auf Eis stellen. Wenn die Lymphdrüsen fluoreszierende Proteine exprimieren, halten Sie die Platte abgedeckt, um Photobleiche zu verhindern.
- Verwenden Sie eine p200-Pipette, um das Fixiermittel vorsichtig zu entfernen.
- Waschen Sie, indem Sie 200 μl 1x PBS in die Vertiefung geben und die Platte für 5 Minuten bei Raumtemperatur auf einen Orbitalschüttler stellen. Verwenden Sie eine p200-Pipette, um das PBS vorsichtig zu entfernen.
HINWEIS: Fixierte Lymphdrüsen können bei PBS auf Eis belassen werden, bis die Lymphdrüsen für alle experimentellen Bedingungen präpariert und fixiert sind.
- Wiederholen Sie die Waschschritte noch zwei weitere Male.
- Geben Sie 200 μl Permeabilisierungslösung (Tabelle 1) in die Vertiefung. Stellen Sie die Platte für 45 min bei RT.
auf einen Orbitalschüttler.
HINWEIS: 45 min ist der "Goldstandard" für die Permeabilisierung der Lymphdrüsen, aber die Autoren haben bereits nach 20 min Erfolg.
- Entfernen Sie die Lösung mit einer p200-Pipette.
- Verdünnen Sie den Primärantikörper mit einer Antikörperlösung (Tabelle 1) gemäß den Spezifikationen des Anbieters. Geben Sie 300 μl Primärantikörperlösung in die Vertiefung und stellen Sie sicher, dass das präparierte Gewebe vollständig untergetaucht ist. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Verwenden Sie eine p200-Pipette, um den primären Antikörper zu entfernen.
- Waschen Sie, indem Sie 200 μl 1x PBS in die Vertiefung geben und die Platte für 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einen Orbitalschüttler stellen. Verwenden Sie eine p200-Pipette, um das PBS vorsichtig zu entfernen.
- Wiederholen Sie die Waschschritte noch zwei weitere Male.
- Verdünnen Sie den Sekundärantikörper mit einer Antikörperlösung gemäß den Spezifikationen des Anbieters. Geben Sie 300 μl Sekundärantikörperlösung in die Vertiefung und stellen Sie sicher, dass das präparierte Gewebe vollständig untergetaucht ist. Inkubieren Sie mindestens 2 Stunden lang auf einem Orbitalschüttler bei RT.
- Verwenden Sie eine p200-Pipette, um den Sekundärantikörper zu entfernen, und waschen Sie ihn wie in den Schritten 1.3.12 und 1.3.13 beschrieben. Entfernen Sie das PBS nach der letzten Wäsche nicht.
- Anlagerung der Lymphdrüsen
- Reinigen Sie Glasobjektträger mit 70 % Ethanol (Tabelle 1) und Gewebetüchern.
- Geben Sie für jede Versuchsbedingung einen Tropfen Einbettpuffer (Tabelle 1) auf den Objektträger.
HINWEIS: Zwei Bedingungen passen auf eine Folie. Das Volumen des Montagepuffers hängt von der Anzahl der zu montierenden Lymphdrüsen ab. Verwenden Sie 2 μl für ca. 18 - 20 Lymphdrüsen, 1 μl für 10 - 12 und 0,5 μl für 5 oder weniger.
- Legen Sie den Objektträger auf eine beleuchtete Stereomikroskopbasis.
- Übertragen Sie bei bis zu zwei Erkrankungen gleichzeitig alle Lymphdrüsen mit einer Pinzette aus der Vertiefung in den Montagepuffer, wobei Sie die Mundhaken oder den ventralen Nervenstrang als Griff verwenden.
- Verteilen Sie das präparierte Gewebe gleichmäßig in einer kreisförmigen oder rechteckigen Form und verteilen Sie dabei den Einbettungspuffer.
- Schieben Sie für jedes der präparierten Gewebe einzeln eine Zange der Pinzette unter das dorsale Gefäß und ziehen Sie sie vorsichtig in Richtung der Peripherie des Montagepuffers.
HINWEIS: Dadurch wird die Lymphdrüse aus dem restlichen präparierten Gewebe herausgezogen und die Lymphdrüse auf dem Glas abgeflacht.
- Mit einer Zange der Pinzette und einer Sägebewegung wird das dorsale Gefäß zwischen Lymphdrüse und Gehirn durchtrennt.
- Bewegen Sie den Rest des präparierten Gewebes auf die gegenüberliegende Seite der Lymphdrüse, an den äußersten Rand des Puffers.
HINWEIS: Das unerwünschte präparierte Gewebe bildet schließlich einen Perimeter um die Lymphdrüsen und dient als Stütze, auf der das Deckglas ruht.
- Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Lymphdrüsen von den präparierten Geweben getrennt sind, und reservieren Sie eines der unerwünschten präparierten Gewebe, um es in der Mitte zu platzieren.
- Nehmen Sie ein Deckglas zwischen zwei Finger. Vergewissern Sie sich, dass das Deckglas frei von Staub und Fingerabdrücken ist. Verwenden Sie bei Bedarf ein Taschentuch und 70 % Ethanol, um das Deckglas zu reinigen.
- Achten Sie darauf, dass die Kante des Deckglases parallel zur Kante des Objektträgers verläuft, und senken Sie das Deckglas vorsichtig über den Montagepuffer ab.
HINWEIS: Objektträger können vor der Bildgebung bei 4 °C gelagert werden. Die maximale Lagerzeit hängt von der Stabilität der verwendeten Antikörper ab. 24-Well-Platten können gespült und wiederverwendet werden.
2. Bildgebung
- Fixierte Hämozyten und montierte Lymphdrüsen auf einem geeigneten Standard-Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop bei 20-facher oder höherer Vergrößerung gemäß Bedienungsanleitung des Herstellers abbilden. Ganze Larven auf einem Standard-Stereomikroskop bei 2-facher Vergrößerung gemäß Bedienungsanleitung des Herstellers abbilden.
- Befolgen Sie bei Bedarf die Anweisungen des Softwareanbieters zur Entfaltung.
