Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Kelly et al., Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017).
1. Vorbereitung der Sezierstation
- Positionieren Sie das Stereomikroskop und die Lichtquelle mit den angebrachten faseroptischen Schwanenhälsen auf einer großen Tischplatte. Um ruhige Handbewegungen zu fördern und das "Zittern" der Hand beim Präparieren zu reduzieren, ist es wichtig, dass rund um das Mikroskop ausreichend Platz für Hand- und Armlehnen zur Verfügung steht. Stellen Sie sicher, dass auf beiden Seiten des Mikroskops ein Abstand von ca. 8 bis 10 Zoll und zwischen der Basis des Mikroskops und der Kante der Bank ein Abstand von 4 bis 6 Zoll vorhanden ist.
- Füllen Sie 2 oder 3 Vertiefungen einer 9-Well- oder 3-Well-Glasschale mit 1,0 mL PTN-Puffer (0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2, 0,1 % nichtionisches Tensid, siehe Materialtabelle für vollständige Pufferkomponenten) und legen Sie sie neben die Präparierstation auf Eis. Neu präparierte Gehirne werden in diese Schale übertragen und bis zum Fixierungsschritt gelagert.
HINWEIS: Wenn eine Live-Bildgebung erforderlich ist, sollte der Dissektionspuffer 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder HL3-Puffer sein. Wenn eine intrazelluläre Proteinlokalisierung erforderlich ist, kann PBS auch als alternativer Puffer für die Dissektion und Fixierung verwendet werden. Nach der Fixierung sollte die Permeabilisierung der Zellmembranen dann mit PTN-Waschmitteln durchgeführt werden, die 0,1 % oder 0,3 % nichtionisches Detergens enthalten.
- Wenn PBS zum Sezieren und Fixieren verwendet wird, sollten Pipettenspitzen mindestens einmal mit einem reinigungsmittelhaltigen Puffer (z. B. PTN) gespült werden, um zu verhindern, dass das Gehirn während des Transfers in Mikrozentrifugenröhrchen an den Pipettenspitzen aus Kunststoff haften bleibt.
- Konstruieren Sie aus einer leeren 35-mm-Petrischale aus Glas oder Kunststoff eine Sezierschale, die ein Silikonelastomer enthält. Kurz die Elastomerkomponenten nach Herstellerangaben mischen, in 35 mm Schalen füllen und über Nacht auf einer ebenen Fläche polymerisieren lassen. Zum Schutz der feinen Spitzen der Präparierzange sollten elastomerhaltige Präparierschalen verwendet werden, die leicht beschädigt werden können, wenn die Pinzette mit einer härteren Oberfläche, wie z. B. einer Glasschale, in Berührung kommt. Wir kaufen auch regelmäßig handelsübliche silikonbeschichtete Schalen von Online-Händlern ein. Um den Kontrast beim Sezieren zu erhöhen, eignen sich besonders nützliche Präparierschalen aus Silikonelastomer, die inaktivierte Aktivkohle enthalten (und somit schwarz gefärbt sind).
2. Verfahren zur Dissektion des Gehirns bei Erwachsenen
- Betäuben Sie den 3 - 5 Tage alten erwachsenen D. melanogaster mit CO2 oder mit Eis. Wenn Sie Eis verwenden, stellen Sie das Fläschchen mit den Fliegen kopfüber (Steckende nach unten) für ~5 Minuten in einen Eiskübel. Wenn Sie das Fläschchen kopfüber ins Eis stellen, wird verhindert, dass sich Fliegen im Futter festsetzen. Sobald die Fliegen betäubt wurden, legen Sie die Fliegen auf ein kaltes Metallpolster oder eine Petrischale, die im Eis sitzt, oder auf ein CO2 emittierendes Fliegenkissen. Bei der Präparierung von Gehirnen zur Analyse der Neurodegeneration können auch ältere Fliegen verwendet werden.
- Geben Sie eine kleine Menge (150 - 200 μl) PTN mit einer Transferpipette oder einer p200-Pipette in die Mitte der Sezierschale, um eine "Blase" aus PTN zu erzeugen. Stellen Sie die Sezierschale unter das Stereomikroskop und stellen Sie die Beleuchtung und den Fokus so ein, dass die PTN-Blase das Sichtfeld ausfüllt und gleichmäßig beleuchtet wird.
- Manipulieren Sie Fliegen so, dass sie "mit dem Bauch nach oben" (d.h. mit der Bauchseite nach oben) liegen, während sie auf dem Metall- oder CO2 -Pad liegen.
- Fassen Sie mit einer Pinzette #5 den Bauch einer Fliege an, die präpariert werden soll, und halten Sie die Fliege fest und tauchen Sie sie vollständig in das PTN auf der Sezierschale.
HINWEIS: Für den Rest des Protokolls sollten alle Schritte ausgeführt werden, während der Kopf in PTN eingetaucht ist.
- Fassen Sie mit einer zweiten Pinzette #5 die Basis des Fliegenrüssels und ziehen Sie die beiden Pinzettenpaare auseinander, um den Fliegenkopf vom Körper zu lösen. Entsorgen Sie den Bauch und den Brustkorb. Während dieses Schritts ist es entscheidend, dass der Kopf nicht losgelassen wird und auf der Oberfläche des PTN schweben kann. Sobald der Kopf schwebt, kann es sehr schwierig sein, ihn wieder zu greifen, ohne das Gehirn zu zerquetschen.
HINWEIS: Bei dieser Methode werden Verbindungen zwischen dem Gehirn und dem ventralen Nervenstrang durchtrennt. Wenn intakte Verbindungen zwischen diesen Regionen des ZNS erforderlich sind, sollte ein alternatives Dissektionsprotokoll befolgt werden. Wenn sich der Rüssel vom Fliegenkopf löst, bevor der Kopf entfernt wird, entsteht an der Stelle, an der sich der Rüssel befand, ein Loch. Fassen Sie in diesem Fall den Fliegenkopf am Rand des Lochs in der Nähe eines Auges. Entfernen Sie dann den Kopf mit mäßiger Kraft, während Sie die beiden Pinzettenpaare voneinander ziehen. Gelegentlich, wenn der Kopf aus dem Körper entfernt wird, bleibt der Darm und/oder der ventrale Nervenstrang am Kopf befestigt und sollte entfernt werden, bevor die Dissektion fortgesetzt wird.
- Während eine Pinzette den Rüssel greift, sollte das zweite Paar den medialen Rand des rechten Fliegenauges greifen. Ziehen Sie die Pinzette langsam auseinander. Dieser Schritt sollte mit einer geringen gleichmäßigen Querkraft durchgeführt werden. Wenn sich die Pinzetten langsam voneinander entfernen, sollte sich der Rüssel vom Kopf lösen und ein zentrales Loch in der Kopfkutikula bilden. Entsorgen Sie den Rüssel mit der ersten Pinzette, ohne den medialen Teil des rechten Auges vom zweiten Paar zu lösen.
HINWEIS: Das adulte Gehirn von D. melanogaster befindet sich im kaudalen (d.h. hinteren/hinteren) Bereich des Fliegenkopfes. Daher sollte das Greifen in diese Region des Kopfes vermieden werden. Im Idealfall sollte nur der rostrale (d. h. vordere) Teil des Kopfes in der Nähe der medialen Netzhaut direkt von der Pinzette erfasst werden. Das Gehirn und die dazugehörige Luftröhre sollten nun durch das zentrale Loch in der Nagelhaut sichtbar sein. Zu diesem Zeitpunkt können alle weißen, fadenförmigen Fäden der Luftröhre, die aus dem Loch herausragen, entfernt und entsorgt werden.
- Fassen Sie mit der zweiten Pinzette den medialen Rand der linken Netzhaut (am Rand des zentralen Lochs in der Nagelhaut des Kopfes). Um die Netzhaut und die dazugehörige Nagelhaut zu entfernen, ziehen Sie die Pinzette langsam in einem Winkel von 180° voneinander weg. Wenn sich die Netzhaut vom darunter liegenden Sehlappen löst, sollten Sie eine leichte Abnahme der Spannung spüren. Gehen Sie langsam vor, um ein Einreißen des Sehlappens zu verhindern.
HINWEIS: Ein zu schnelles Trennen der Pinzette während dieses Schritts kann zum Reißen des Sehlappens oder zur Störung der Pilzkörperstrukturen führen. Gelegentlich wird die Nagelhaut entfernt, aber Teile der Netzhaut bleiben am Sehlappen haften. Bei der Darstellung der Pilzkörper ist es nicht zwingend notwendig, die gesamte Netzhaut zu entfernen. Die Analyse anderer Hirnregionen (wie z. B. der Innervation der retinalen Neuronen der Sehlappen) kann jedoch eine vollständige Entfernung der Netzhaut erfordern, wie beschrieben.
HINWEIS: Da sich die Netzhaut langsam vom darunter liegenden Sehlappen des Gehirns trennt, sollte der Sehlappen als undurchsichtige weiße Struktur erkennbar sein, die mit weißer, fadenförmiger Luftröhre bedeckt ist. Sobald eine Netzhaut entfernt wurde, kann sie entsorgt werden. Bei der Analyse der Wegfindung von retinalen Neuronen sollte in diesem Schritt besonders darauf geachtet werden, eine Schädigung des Sehlappens zu vermeiden. Ein zusätzliches Protokoll, das sich auf die Dissektion und Live-Bildgebung der Photorezeptor-Neuronen konzentriert, ist ebenfalls verfügbar.
- Entfernen Sie nun vorsichtig so viel wie möglich von der sichtbaren Luftröhre. Die Luftröhre kann bereits Luft enthalten oder sich später mit ihr füllen, was dazu führt, dass das Gehirn schwimmt und möglicherweise bei späteren Immunfärbeschritten verloren geht. Um die Luftröhre zu entfernen, nehmen Sie sie mit einer sehr scharfen Pinzette #5 aus dem Gehirn.
- Entfernen Sie die verbleibende Netzhaut und die umgebende Nagelhaut, indem Sie mit beiden Pinzettenpaaren die mediale Region der Netzhaut der linken Fliege greifen. Reißen Sie die Netzhaut vorsichtig in zwei Hälften, um Teile der Netzhaut und der Nagelhaut zu entfernen. In einigen Fällen erweist es sich als besonders schwierig, die verbleibende Nagelhaut zu entfernen, ohne das Gehirn zu zerquetschen. In diesen Fällen haben wir festgestellt, dass die verbleibenden Stränge des ventralen Nervenstrangs stattdessen mit einer Pinzette erfasst werden können, während mit der anderen Pinzette vorsichtig der letzte Teil der Nagelhaut entfernt wird.
- Bewegen Sie die präparierten Gehirne mit einer p200-Pipette in eine Vertiefung der 9- oder 3-Well-Schale, die PTN enthält. Gehirne desselben Genotyps sollten zusammen in ein und demselben Brunnen zusammengefasst und auf Eis gelegt werden. Das Hirngewebe sollte innerhalb einer Stunde nach der Dissektion fixiert werden. Gehirne können in kleinen Chargen fixiert und gepoolt werden, wenn eine größere Anzahl von Gehirnen benötigt wird. In den meisten Fällen kann ein erfahrener Forscher in der Regel ein Gehirn sezieren und es in etwa 3 - 5 Minuten in die Glassammelschale übertragen.
