$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Koyle et al., Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp.(2016).
1. Legekäfige vorbereiten
- Stellen Sie Traubensaft-Agar-Platten her, indem Sie 100 ml Wasser, 10 g Bierhefe, 10 g Glukose und 1 g Agar in der Mikrowelle erhitzen. In Schritt 1.1 3 Mal zum Kochen bringen und 10 g gefrorenes Traubensaftkonzentrat hinzufügen, um die Sichtbarkeit der Eier auf der Agarplatte zu erhöhen.
- Wenn der Agar auf 55 °C abgekühlt ist, werden 20 ml in 100 mm Petrischalen gegossen und fest werden gelassen.
- Bedecken Sie die Oberfläche der Agarplatten mit einer Hefepaste, indem Sie 1 g Bierhefe mit 15 g Wasser verrühren. Gießen Sie Hefepaste auf die Agarplatte, achten Sie darauf, dass die Oberfläche bedeckt ist, und gießen Sie dann den Überschuss ab, wobei ein dünner Heferest zurückbleibt. Wenn mehrere Platten verwendet werden, kann die Paste nacheinander auf mehrere Platten gegossen werden.
- Agarplatten in den Boden eines Käfigs geben.
HINWEIS: Ein 32-Unzen-Feinkostbehälter ist ein guter Ersatz für Fliegenkäfige aus Acryl.
- Stellen Sie Deckel für 32-Unzen-Feinkostbehälter her, indem Sie ein Loch in den Deckel schneiden und ein atmungsaktives Netz mit ungiftigem Klebstoff über das Loch kleben. Wenn der Kleber wasserlöslich ist, verhindern Sie, dass der Deckel mit Wasser in Berührung kommt.
- 200-300 Fliegen in den Behälter geben und mit Deckel abdecken. Decken Sie das netzgeschützte Loch mit einem leeren Petrischalendeckel ab, um eine Verdunstung von der Agaroberfläche zu verhindern, und fügen Sie bei Bedarf ein feuchtes Seidenpapier in den Deckel ein. Inkubieren Sie die Fliegen bei 25 °C über Nacht für 16-20 Stunden.
2. Eier sammeln
- Bereiten Sie ein Sieb für die Eiersammlung vor, indem Sie ein Nylonnetz in eine Kunststoffbuchse legen.
- Um den Teller mit den Eiern darauf zu holen, entfernen Sie die Fliegen aus dem Käfig, indem Sie sie in einen leeren Behälter umfüllen. Wenn die gleichen Fliegen am nächsten Tag verwendet werden, setzen Sie sie sofort in einen neuen Käfig um, der eine frisch gehefehaltige Traubensaft-Agar-Platte enthält. Fliegen können für 3-5 aufeinanderfolgende Tage verwendet werden
- Entferne tote Fliegen mit einem sauberen Pinsel vom Agar und achte darauf, dass der Agar nicht zerbrochen wird.
- Sammeln Sie Eier, indem Sie die Agarplatte mit destilliertem Wasser spülen, die Eier vorsichtig von der Agaroberfläche bürsten und die Aufschlämmung über das Netz gießen. Wiederholen Sie dies 3-4 Mal, bis alle oder die meisten Eier von der Agarplatte entfernt wurden.
3. Eier dechorionieren und auf steriles Futter umstellen
- Bereiten Sie die Biosicherheitswerkbank vor, indem Sie die Innenseite (einschließlich der Seiten) mit 70 % Ethanol besprühen. Wischen Sie den Boden mit einem Labortuch ab und sterilisieren Sie die Haube ~15 Minuten lang mit UV-Licht. Sterilisieren Sie alle nicht-biologischen Verbrauchsmaterialien (Probenbecher, Pinsel, Pinzette, Abfallbehälter, 400 ml sterilisiertes Wasser und 100 ml 0,6 % Natriumhypochlorit), indem Sie es mit Ethanol besprühen und sofort in die Biosicherheitswerkbank legen. 15 min mit UV-Licht sterilisieren.
- Starten Sie die erste von 2 Natriumhypochlorit-Waschungen, indem Sie die Buchse mit den Eiern in einen 120-ml-Probenbecher oder einen anderen sterilen Behälter geben. Gießen Sie langsam ~90 ml 0,6%ige Natriumhypochloritlösung in die Buchse bis knapp unter den Rand.
- Spülen Sie die Eier 2,5 Minuten lang. Suspendieren Sie die Eier regelmäßig, indem Sie die Buchse mit einer Pinzette in der Hypochloritlösung auf und ab bewegen.
- Übertragen Sie die Buchse direkt in einen zweiten Probenbecher, der mit 90 ml Bleiche vorgefüllt ist, in der Biosicherheitswerkbank.
- Wiederholen Sie Schritt 3.3 in der Biosicherheitswerkbank. Am Ende der zweiten Bleichbehandlung sollten die Eier beginnen, an den Seiten der Buchse zu haften.
- Führen Sie die Schritte 3.7-3.8 in der Biosicherheitswerkbank durch.
- Entsorgen Sie das Bleichmittel und waschen Sie die Buchse 3 Mal mit sterilem Wasser. Hängen Sie die Eier bei jedem Waschen mehrmals auf, indem Sie die Buchse mit einer Pinzette bewegen. Am Ende der dritten Wäsche sollten die meisten Eier an der Seite der Buchse befestigt sein.
- Übertragen Sie die Eier mit einem in Ethanol sterilisierten Pinsel von der Seite der Buchse auf das sterile Futter. Übertragen Sie Eier einzeln oder in kleinen Chargen. Streben Sie 30-50 Eier pro Fläschchen an. Lassen Sie die Kappen locker, damit Sauerstoff in den Schlauch eindringen kann.