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Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Koyle et al., Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp. (2016).
1. Eier dechorionieren und auf sterile Ernährung umstellen
- Bereiten Sie die Biosicherheitswerkbank vor, indem Sie die Innenseite (einschließlich der Seiten) mit 70 % Ethanol besprühen. Wischen Sie den Boden mit einem Labortuch ab und sterilisieren Sie die Haube ~15 Minuten lang mit UV-Licht. Sterilisieren Sie alle nicht-biologischen Verbrauchsmaterialien (Probenbecher, Pinsel, Pinzette, Abfallbehälter, 400 ml sterilisiertes Wasser und 100 ml 0,6 % Natriumhypochlorit), indem Sie es mit Ethanol besprühen und sofort in die Biosicherheitswerkbank legen. 15 min mit UV-Licht sterilisieren.
- Starten Sie die erste von 2 Natriumhypochlorit-Waschungen, indem Sie die Buchse mit den Eiern in einen 120-ml-Probenbecher oder einen anderen sterilen Behälter geben. Gießen Sie langsam ~90 ml 0,6%ige Natriumhypochloritlösung in die Buchse bis knapp unter den Rand.
- Spülen Sie die Eier 2,5 Minuten lang. Suspendieren Sie die Eier regelmäßig, indem Sie die Buchse mit einer Pinzette in der Hypochloritlösung auf und ab bewegen.
- Übertragen Sie die Buchse direkt in einen zweiten Probenbecher, der mit 90 ml Bleiche vorgefüllt ist, in der Biosicherheitswerkbank.
- Wiederholen Sie Schritt 1.3 in der Biosicherheitswerkbank. Am Ende der zweiten Bleichbehandlung sollten die Eier beginnen, an den Seiten der Buchse zu haften.
- Führen Sie die Schritte 1.7-1.8 in der Biosicherheitswerkbank durch.
- Entsorgen Sie das Bleichmittel und waschen Sie die Buchse 3 Mal mit sterilem Wasser. Hängen Sie die Eier bei jedem Waschen mehrmals auf, indem Sie die Buchse mit einer Pinzette bewegen. Am Ende der dritten Wäsche sollten die meisten Eier an der Seite der Buchse befestigt sein.
- Übertragen Sie die Eier mit einem in Ethanol sterilisierten Pinsel von der Seite der Buchse auf das sterile Futter. Übertragen Sie Eier einzeln oder in kleinen Chargen. Streben Sie 30-50 Eier pro Fläschchen an. Lassen Sie die Kappen locker, damit Sauerstoff in den Schlauch eindringen kann. Wenn die Durchstechflaschen axenisch bleiben sollen, in einen Insektenbrutkasten umfüllen; Andernfalls fügen Sie Bakterien wie folgt hinzu.
2. Mache gnotobiotische Fliegen mit 4 Bakterienarten
- Bakterien vorbereiten
- Bereiten Sie eine sterilisierte Biosicherheitswerkbank mit den erforderlichen Verbrauchsmaterialien (Pipetten, Pipettenspitzenboxen, sterilisierte Zentrifugenröhrchen, MRS-Brühe und Reagenzglasgestelle) vor, wie in Schritt 1.1 beschrieben. Wischen Sie die Außenseite der Reagenzgläser mit einem mit Ethanol getränkten Labortuch ab, bevor Sie sie in die Biosicherheitswerkbank legen.
- Pelletieren Sie die Bakterien, indem Sie zunächst 500 μl des Übernachtwachstums in ein steriles Mikrofuruge-Röhrchen überführen. Wenn die Bakteriendichte niedrig ist, geben Sie bis zu 1,5 ml in jedes Röhrchen oder entfernen Sie nacheinander den Überstand und geben Sie zusätzliche Kultur in dasselbe Röhrchen. Proben aus der Biosicherheitswerkbank entnehmen und 10 min bei 10.000 x g zentrifugieren. Verwenden Sie Filterspitzen, um eine Kontamination zwischen den Proben zu vermeiden.
- Bestimmen Sie die Dichte jeder Kultur, indem Sie OD600 messen. Wenn Sie einen Multi-Well-Platten-Reader verwenden, übertragen Sie 200 μl jeder Kultur in 1-, 2- und 4-facher Verdünnung auf eine 96-Well-Platte.
- Die Menge an mMRS, in der jedes Zellpellet (2.1.2) verdünnt werden soll, wird mit einem Plattenablese-Spektralphotometer und den folgenden Gleichungen bestimmt. Planen Sie, genügend Brühe hinzuzufügen, um 50 μl in jedes Fläschchen zu impfen.
- Erfassen Sie OD600-Messwerte für eine 1:1-, 1:2- und 1:4-Verdünnung jeder Bakterienkultur auf einem Plattenablese-Spektralphotometer. Für jeden Bakterienstamm, der einen OD600-Wert zwischen 0,1 und 0,2 ergibt, wird die Verdünnung gewählt, und dieser Wert und der entsprechende Verdünnungsfaktor werden in den Formeln in 2.1.4.2 oder 2.1.4.3 als "O" und "D" verwendet.
- Wenn Sie die hier beschriebenen 4 Spezies verwenden, normalisieren Sie die Zellen auf äquivalente koloniebildende Einheiten (KBE)/ml-Dichten (OD600 zu KBE Umwandlung zuvor in Newell und Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) mit dieser Gleichung:
E = ((O-B) x V x T)/C
wobei E = Volumen für die Resuspendierung des Pellets (μl), O = OD600 Bakterien, B = OD600 Blindmedium, D = Faltenverdünnung, V = μl Bakterienkultur vor der Zentrifugation, C =OD 600 der vorgegebenen Konstante. Beispiele für Berechnungen mit diesen Gleichungen finden Sie unter Ergänzende Codedatei. Bei Spektralphotometern, die automatisch ausblenden, verwenden Sie "O" anstelle von "O-B".
HINWEIS: Die vorgegebenen Konstanten (Einheiten OD600, normiert auf 107 CFU ml-1, Konstanten abgeleitet in Newell und Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) sind wie folgt: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
- Wenn Sie andere Bakterienspezies verwenden (es ist keine KBE/OD600-Konstante verfügbar), normalisieren Sie die Dichte auf OD600 = 0,1 mit dieser Gleichung:
E = ((O-B) x V x T)/0,1 OD600
HINWEIS: Die Einheiten sind die gleichen wie in Schritt 2.1.4.2. Beispiele für Berechnungen mit diesen Gleichungen finden Sie unter Ergänzende Codedatei.
- In der Biosicherheitswerkbank wird der Überstand mit einer Pipettenspitze entfernt und das Pellet in frischem mMRS oder PBS resuspendiert, wie in Schritt 2.1.4.2 berechnet.
- Bakterien impfen
- 50 μl der Bakterien mit sterilem Futter und dechorionierten Eiern in die Biosicherheitswerkbank in die konischen Röhrchen überführen. Fügen Sie nach dem Eitransfer Bakterien hinzu, um eine Kontamination zwischen den Fläschchen zu verhindern.
- Legen Sie die beimpften Röhrchen in einen Inkubator bei 25 °C.
3. KBE-Belastung messen/Sterilitätstest
durchführen
- Um die KBE-Belastung in Ganzkörperfliegen-Homogenaten zu messen, geben Sie 5 Fliegen (5-7 Tage nach der Eklosion) in ein 1,7-ml-Mikrofuge-Röhrchen mit 125 μl Keramikkügelchen und 125 μl mMRS-Brühe. Homogenisieren Sie Fliegen mit einem Gewebehomogenisator für 30 Sekunden bei 4,0 M/s.
- Alternativ Kügelchen weglassen und in Mikrozentrifugenröhrchen mit Kunststoffstößeln 1 min von Hand homogenisieren.
- Bei der Quantifizierung der Darmmikrobiota sterilisieren Sie die Fliegen an der Oberfläche, um exogene Mikroben zu entfernen. Übertragen Sie die Fliegen für 1 Minute in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 μl 70 % Ethanol, aspirieren Sie Ethanol und übertragen Sie es zur Homogenisierung in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Wenn der DNA-Gehalt des Darms gemessen werden soll, spülen Sie vor der Ethanolwäsche 1 min lang mit 0,6% Natriumhypochlorit.
- Verdünnen Sie das Homogenat mit 875 μl mMRS, wirbeln Sie es 5 Sekunden lang vor und pipettieren Sie 120 μl Homogenat in die erste Vertiefung einer Mikrotiterplatte.
- Führen Sie zwei aufeinanderfolgende 1:8-Verdünnungen mit 10 μl Homogenat und 70 μl MRS in den nächsten beiden Wells durch.
- Entnehmen Sie 10 μl aus der ersten Vertiefung und geben Sie sie in die zweite Vertiefung mit 70 μl MRS. Mischen Sie den Inhalt der zweiten Vertiefung gründlich, übertragen Sie 10 μl aus der zweiten Vertiefung in die dritte Vertiefung mit 70 μl MRS und mischen Sie gründlich. Dies führt zu 3 Gesamtkonzentrationen des ursprünglichen 1.000 μl Homogenats: unverdünnt, 1:8 und 1:64.
- Übertragen Sie 10 μl jeder Verdünnung auf eine mMRS-Platte (auf Wunsch mit einer Mehrkanalpipette). Neigen Sie die Schale leicht, um die Verdünnung mehrere Millimeter auf der Agaroberfläche zu verteilen, und lassen Sie die Flüssigkeit trocknen, bevor Sie die Platte bewegen. Die Flüssigkeit trocknet schnell auf der Platte, wenn die Platten 2 Tage alt sind, wodurch die Vermischung von zwei benachbarten Tröpfchen reduziert wird.
Bei - 30 °C 1-2 Tage inkubieren. Nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator, sobald sie voneinander entfernt sind, sind einzelne Völker sichtbar, und zählen Sie ab einer Verdünnung mit 10-100 isolierten Völkern.
- Berechnen Sie KBE pro Fliege anhand der Gleichung E = C x D/P x V/F, wobei E = KBE pro Fliege, C = Anzahl der gezählten Kolonien, D = Verdünnung, P = μl plattiert, V = Volumen des Fliegenhomogenats und F = Anzahl der homogenisierten Fliegen.