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Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Guan et al., Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle, J. Vis. Exp.(2018).
1. Dissektion und Fixierung von Beinen
- Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte aus Glas und füllen Sie die entsprechende Anzahl von Wells mit 70 % Ethanol. Geben Sie 15–20 CO2 -betäubte Fliegen (beiderlei Geschlechts und Alters) in jede Vertiefung und tupfen Sie die Fliegen mit einem Pinsel vorsichtig in die Ethanollösung, bis die Fliegen vollständig untergetaucht sind.
HINWEIS: Dieser Schritt dient dazu, die Hydrophobie der Nagelhaut zu entfernen. Nicht länger als 1 min waschen, da dies die Autofluoreszenz der Nagelhaut erhöht.
- Spülen Sie die Fliegen 3 Mal mit 0,3 % nichtionischer Tensidwaschlösung in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ab. Bewahren Sie die Fliegen mindestens 10 Min. < />
HINWEIS: Die Beine werden besser fixiert, wenn Reinigungsmittel hinzugefügt wird, was wahrscheinlich das Eindringen des Fixiermittels in das Bein erhöht.
- Legen Sie eine Multi-Well-Platte zusammen mit einem Röhrchen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) auf das Eis.
HINWEIS: Die Herstellung von frischem 4 % PFA aus einer 16 % PFA-Ethanol-freien Stammlösung ist von entscheidender Bedeutung.
Entfernen Sie - mit einer Pinzette den Kopf und den Bauch der Fliegen, ohne das Brustsegment oder die Beine zu beschädigen.
HINWEIS: Das Entfernen des Bauches erleichtert das Halten der Fliege und das Präparieren der Beine.
- Präparieren Sie die Beine mit einer Pinzette vom Thoraxsegment und legen Sie die Beine in die Vertiefungen, die 4 % PFA enthalten. Drücken Sie dazu mit der Spitze einer feinen Pinzette sanft, aber fest auf den Coxa-Thorax-Übergang, bis sich das Bein löst.
- Fixieren Sie die Beine über Nacht bei 4 °C (insgesamt ca. 20 Stunden) in 4 % PFA.
- Waschen Sie die Beine mit 0,3 % nichtionischer Tensidwaschlösung in 1x PBS, 5x für jeweils 20 Minuten.
- Ersetzen Sie den Waschpuffer durch Eindeckmedium. Bewahren Sie das Bein vor der Montage mindestens einen Tag lang in Eindeckmedium auf, damit es vollständig in das Bein eindringen kann.
HINWEIS: Wenn das Eindeckmedium hochviskos ist, verdünnen Sie das Einbettmedium auf 80 % mit 1x PBS, da die plötzliche Änderung der Viskosität dazu führen kann, dass die Nagelhaut zusammenbricht und die Gesamtstruktur des Beins beschädigt wird. Je nach Gal4-Treiber können Fliegen bis zum Einbau 1 bis 3 Wochen bei 4 °C in Eindeckmedien konserviert werden.
2. Beinmontage
- Legen Sie ca. 20 μl 70%iges Glycerin auf die linke Seite eines Objektträgers und bedecken Sie es mit einem quadratischen Deckglas 22 x 22 mm2 (Abbildung 1A,B). Etwa 10 μl Eindeckmittel entlang einer Linie parallel zum rechten Rand dieses Deckglases und in geringem Abstand vom rechten Rand dieses Deckglases pipettieren. Geben Sie weitere 30 μl Eindeckmedium weiter auf der rechten Seite des Objektträgers hinzu (Abbildung 1C).
HINWEIS: Beim Anbringen eines Deckglases über den Beinen (siehe unten) verteilt sich das Eindeckmittel sanft unter dem Deckglas und um die Beine herum, ohne sie zu verschieben.
- Heben Sie das Bein mit einer feinen Pinzette von der Lösung ab und legen Sie es vorsichtig auf das Eindeckmedium in der Nähe des linken Deckglases. Machen Sie das Gleiche für jeden Schenkel und richten Sie sie von oben nach unten aus (Abbildung 1D).
- Heben Sie die Beine an und übertragen Sie sie in einen Tropfen Medium, der zwischen beiden Spitzen der Pinzette gehalten wird. Richten Sie die Beine auf zwei Arten aus: mit der Außenseite nach oben oder nach unten.
- Sobald alle Beine (es können bis zu 6–8 Beine montiert werden) richtig ausgerichtet sind, legen Sie ein zweites Deckglas über die Beine, so dass dieses Deckglas leicht auf dem zuvor platzierten Deckglas aufliegt Abbildung 1E, um Platz zwischen dem Deckglas und dem Gewebe zu schaffen und eine Beschädigung der Beine zu verhindern (Abbildung 1G).
HINWEIS: Alternativ können Sie Aufklebermulden oder kieferorthopädisches Wachs verwenden, um Platz zwischen Deckglas und Objektträger zu schaffen.
- Verwenden Sie einen Nagellack, um die Position der Deckgläser an jeder Ecke zu sichern (Abbildung 1F).
HINWEIS: Das Gewebe ist nun bereit für die Bildgebung.
