$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Radford und McKim, Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016).
HINWEIS: Die Eingriffe werden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Sofern nicht anders angegeben, werden temperaturgesteuerte Brutschränke verwendet, um die Temperaturen für die Fliegenaufzucht und Kreuzungen aufrechtzuerhalten.
1. Vorbereitungen
- Fliegen vorbereiten.
- Mit Prometaphase angereicherte Eizellentnahmen.
- Adulte Fliegen aus gesunden, jungen Beständen oder Kreuzungskulturen entfernen. Flaschen zwei Tage bei 25 °C reifen lassen.
HINWEIS: Im Allgemeinen reichen zwei gesunde Flaschen aus, obwohl für einige Kreuzungen auch mehr erforderlich sein können.
- Sammeln Sie nach zwei Tagen ~100 bis 300 Weibchen (die zu diesem Zeitpunkt 0 bis 2 Tage alt sind) aus den Flaschen. Die Weibchen müssen keine Jungfrauen sein. Geben Sie einen Klecks Hefepaste an die Seite eines Fläschchens und geben Sie jeweils 30 weibliche und 10 bis 15 männliche Tiere in die Hefefläschchen. Fläschchen zwei Tage lang bei 25 °C haltbar machen.
- Mit Metaphase angereicherte Eizellensammlungen.
- Sammeln Sie ~100 bis 300 Weibchen aus Stamm- oder Kreuzkulturen. Geben Sie einen Klecks Hefepaste an die Seite eines Fläschchens und geben Sie jeweils 30 weibliche Sorten (ohne Zugabe von Männchen) in die Hefefläschchen. Fläschchen für drei bis fünf Tage bei 25 °C haltbar machen.
- Lösungen vorbereiten.
HINWEIS: Lösungen können, sofern nicht anders angegeben, unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden.
- Bereiten Sie modifizierten Robb-Puffer (5x) vor: 500 mM HEPES, 500 mM Saccharose, 275 mM Natriumacetat, 200 mM Kaliumacetat, 50 mM Glukose, 6 mM Magnesiumchlorid und 5 mM Calciumchlorid. Verwenden Sie 10 N 11:8 Natriumhydroxid:Kaliumhydroxid, um den pH-Wert auf 7,4 zu bringen. Sterilisieren durch Filtration; Nicht autoklavieren. Bei -20 °C lagern. Nach Bedarf auftauen, um ~200 ml 1x Robb's pro Eizellvorbereitung zuzubereiten.
- Lösungen für die Fixierung.
- Option #1: Bereiten Sie die Formaldehyd/Heptan-Fixierung vor. Fixierungspuffer vorbereiten: 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) plus 150 mM Saccharose. Zur Verwendung mit 687,5 μl Fixierungspuffer und 312,5 μl 16 % Formaldehyd pro Eizellvorbereitung frisch machen
Vorsicht: Tragen Sie Handschuhe, wenn Sie Formaldehydlösungen in einem Abzug verwenden. Entsorgen Sie Abfälle gemäß den institutionellen Richtlinien.
- Option #2: Bereiten Sie die Formaldehyd/Cacodylat-Fixierung vor. Prepare Fix Mix: 250 mM Saccharose, 100 mM Kaliumacetat (pH 7,5), 25 mM Natriumacetat (pH 7,0) und 25 mM EGTA (pH 8,0). Zur Verwendung mit 400 μl Fix Mix, 100 μl Kaliumcacodylat (1 M, pH 7,2) und 500 μl 16 % Formaldehyd pro Eizellvorbereitung frisch machen
Vorsicht: Kaliumcacodylat enthält Arsen.
- PBS/Triton X-100 vorbereiten: 1x PBS plus 1% oder 0,05% Triton X-100. Bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie PBS-Tween 20-Rinderserumalbumin (BSA) (PTB) vor: 1x PBS, 0,5 % BSA (w/v) und 0,1 % Tween-20. Kann eine Woche lang bei 4 °C gelagert werden.
2. Entnahme von Drosophila-Eizellen im Spätstadium
- Da Drosophila-Eizellen mit intakten Membranen an Kunststoff und Glas haften, beschichten Sie die Innenseite eines 5-ml-Röhrchens und eine Pasteurpipette pro Eizellvorbereitung mit PTB.
- Betäuben Sie alle ~100 bis 300 Hefefliegen mit Kohlendioxid und geben Sie sie in einen Mixer mit ~100 ml 1x Robb's Buffer. Pulsieren Sie dreimal (jeweils ~1 Sek.). Bewahren Sie die Eizellen für <20 Minuten in Robb's auf, um eine Aktivierung zu vermeiden.
HINWEIS: Alternativ können Eizellen von Frauen von Hand präpariert werden. Der Vorteil dieser Methode ist, dass weniger Weibchen benötigt werden. Es muss jedoch darauf geachtet werden, die Exposition gegenüber Kohlendioxid auf nur wenige Minuten zu begrenzen, um Artefakte zu vermeiden, die mit Hypoxie in Verbindung gebracht werden.
- Filtern Sie durch ein großes Netz (~1.500 μm) in ein 250-ml-Becherglas, um große Körperteile zu entfernen. Wenn viele intakte Bäuche auf dem Netz verbleiben, zermahle das Material erneut mit zusätzlichem Robb's Buffer und filtere erneut. Lassen Sie ~2 Minuten einwirken, saugen Sie dann die oberste Schicht ab und entfernen Sie so viele der großen Körperteile wie möglich.
- Durch kleine Maschen (~300 μm) in ein 250 ml Becherglas filtrieren. Spülen Sie die restlichen Eizellen aus dem ersten Becherglas mit zusätzlichen Robb's und beschichteten Pasteurpipetten. Lassen Sie sich ~3 min absetzen; Die Eizellen werden sich absetzen. Saugen Sie alle bis auf ~10 ml ab.
- Gießen Sie so viel von den 10 ml, wie in die beschichtete 5 ml Tube passt. Absetzen lassen, Flüssigkeit entfernen und mit dem Rest wiederholen. Spülen Sie die restlichen Eizellen mit zusätzlichen Robb's und beschichteten Pasteurpipetten aus dem Becherglas. In einer 5-ml-Tube ~3-5 min ziehen lassen.
3. Medikamentöse Behandlungen (optional)
- Für jede Eizellvorbereitung wird ein zweites 5-ml-Röhrchen mit PTB bestreichen und je 1 ml Robb für jede Eizellvorbereitung ein geeignetes Lösungsmittel (Kontrolle) oder Arzneimittel zugegeben (Tabelle 1).
- Die Eizellen in ein zweites beschichtetes 5-ml-Röhrchen aufteilen. Lassen Sie sich absetzen, entfernen Sie die Flüssigkeit und geben Sie 1 ml Robb's plus Lösungsmittel in ein Röhrchen und 1 ml Robb's plus Medikament in das zweite Röhrchen. Nutat für eine angemessene Zeitspanne für die medikamentöse Behandlung (Tabelle 1). Lassen Sie sich beruhigen.
4. Fixierung
- Saugen Sie die gesamte Flüssigkeit ab und fügen Sie sofort 1 ml Fix hinzu.
- Option #1: Formaldehyd/Heptan-Fixierung (Fixierungspuffer plus 5% Formaldehyd).
- 2,5 min auf einem Näher fixieren. 1 ml Heptan zugeben und 1 min vortexen. ~1 min ruhen lassen.
- Entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit und fügen Sie dann 1 ml 1x PBS hinzu. Vortex 30 Sek. ~1 min ruhen lassen.
- Entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit und füllen Sie das Röhrchen mit 1x PBS.
HINWEIS: Die Eizellen können sofort verwendet oder mehrere Stunden bei Raumtemperatur auf dem Nähgerät aufbewahrt werden.
- Option #2: Formaldehyd/Cacodylat-Fixierung (Fix Mix plus 8% Formaldehyd und 100 mM Cacodylat).
- 6 min auf einem Nährstoffator fixieren. 2 Min. ruhen lassen. Flüssigkeit entnehmen und dann das Röhrchen mit 1x PBS.
füllen
HINWEIS: Die Eizellen können sofort verwendet oder mehrere Stunden bei Raumtemperatur auf dem Nähgerät aufbewahrt werden.
5. Entfernen von Membranen ("Rollen")
- Geben Sie mit einer beschichteten Pasteurpipette ~500 bis 1.000 Eizellen in den mattierten (sandgestrahlten) Teil eines Objektträgers. Entfernen Sie alle Körperteile und Fremdstoffe mit einer Pinzette. Lassen Sie die Eizellen nicht austrocknen; Fügen Sie bei Bedarf 1x PBS hinzu.
- Legen Sie ein Deckglas auf die Eizellen und "rollen" Sie die Eizellen vorsichtig, bis alle Membranen entfernt sind (am besten ziehen Sie den Rand des Deckglases über die Eizellen). Überprüfen Sie regelmäßig den Fortschritt unter dem Mikroskop und fügen Sie bei Bedarf mehr 1x PBS hinzu. Seien Sie vorsichtig, da zu viel Druck die Eizellen zerstört
.