Mechanische Entfernung der Chorion- und Vitellinmembran: Eine Methode zur Vorbereitung von Drosophila-Eizellen für die direkte Beobachtung

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Perkins und Bickel, Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to monitor the state of arm cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2017).

1. Entfernung von Chorionen und Vitellinmembranen

HINWEIS: Siehe Abbildung 1 für benötigte Werkzeuge.

1. Separieren Sie Eizellen im Spätstadium
   1. Geben Sie 1 ml PBSBTx in eine flache Präparierschale. Verwenden Sie einen P200 mit einer BSA-beschichteten Spitze, um fixierte Eierstöcke (in ~150 μl) in die flache Schale zu übertragen. Pipettieren Sie die Eierstöcke mit der BSA-beschichteten Pipettenspitze auf und ab, um die reifen Eizellen von den weniger reifen Eizellen zu lösen.
   2. Wenn die Eizellen im Spätstadium ausreichend getrennt sind, überführen Sie das gesamte Gewebe in ein 500-μl-Mikrofurchen. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einer gezogenen Pasteurpipette, wobei Sie etwa 150 - 200 μL im Röhrchen belassen. Abschnitt 1.1 für die übrigen Genotypen wiederholen.
2. Vorbereiten zum Rollen
   1. Eine tiefe Welle mit 200 μl PBSBTx vorfeuchten. Abdecken und beiseite stellen. Besorgen Sie sich 3 Objektträger aus Milchglas und legen Sie Objektträger #3 beiseite. Reiben Sie die Milchglasbereiche der Objektträger #1 und #2 vorsichtig aneinander. Spülen Sie sie in entionisiertem Wasser ab, um Glasscherben zu entfernen, und trocknen Sie sie mit einem Einwegtuch ab.
   2. Beschichten Sie die mattierten Bereiche der Objektträger #1 und #2 mit PBSBTx, indem Sie 50 μl PBSBTx zu einem Objektträger hinzufügen und diesen Bereich mit dem anderen Objektträger reiben. Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einem Einwegtuch.
   3. Legen Sie die Objektträger in der in Abbildung 2 A gezeigten Konfiguration unter ein Präpariermikroskop. Halten Sie die mattierten Bereiche der Folien #1 und #2 in Kontakt, wobei Folie #3 die Folie #2 stützt.
3. Rollen Sie die Eizellen; stellen Sie sicher, dass die Drehrichtung immer in einer geraden Linie und niemals in einer kreisförmigen Bewegung verläuft.
   1. Befeuchten Sie eine P200-Pipettenspitze mit PBSBTx und dispergieren Sie die Eizellen im Mikrofuge-Röhrchen, indem Sie auf und ab pipettieren. Übertragen Sie 50 μl Flüssigkeit mit Eizellen in die Mitte des Milchglasteils von Objektträger #1. Heben Sie dazu die Rutsche #2 an.
   2. Senken Sie den Schieber #2 langsam ab, bis die Oberflächenspannung der Flüssigkeit eine Abdichtung zwischen den beiden Milchglasbereichen erzeugt. Es sollte genug Flüssigkeit vorhanden sein, um den vereisten Bereich zu bedecken, aber es sollte keine heraussickern. Wenn die Flüssigkeit überläuft, verwenden Sie eine gezogene Pasteurpipette, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
   3. Halten Sie die untere Rutsche (#1) mit einer Hand fest und bewegen Sie mit der anderen Hand die obere Folie (#2) in horizontaler Richtung hin und her, wobei Sie Folie #2 waagerecht und auf Folie #3 stützend halten. Führen Sie die Durchführung unter einem Mikroskop durch, um die Bewegungen und den Fortschritt der Eizellen leicht zu visualisieren.
      HINWEIS: Diese Bewegung erzeugt Reibung und führt dazu, dass die Eizellen "rollen" und ihre Chorionen verlieren. Es sollte minimaler Druck ausgeübt werden und die Bewegungen sollten kurz und schnell sein.
   4. Nach einigen Bewegungen in horizontaler Richtung ändern Sie den Bewegungswinkel leicht (Abbildung 2B). Erhöhen Sie diesen Winkel in mehreren Schritten allmählich auf 90°, bis die Bewegung des oberen Schlittens senkrecht zur Startrichtung verläuft (Abbildung 2B). Beachten Sie, dass leere Chorionen in der Flüssigkeit sichtbar sind und Eizellen ohne Chorionen länger und dünner erscheinen.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.3 - 1.3.4 ca. 7 - 10 Mal, bis die Lösung leicht trüb wird. Hören Sie auf zu rollen, wenn die Mehrheit der Eizellen (75 - 85%) ihre Vitellinmembranen verloren zu haben scheint.
      HINWEIS: Ein markantes spitzes Ende ist oft bei Eizellen sichtbar, denen die Vitellinmembranen fehlen. Vitellin-Membranen sind schwieriger zu entfernen als Chorionen. Während des Rollens kann leichter Druck auf den oberen Schieber (Schieber #2) ausgeübt werden, um eine Entfernung der Vitellinmembranen zu erreichen. Der Versuch, Vitellinmembranen von allen Eizellen zu entfernen, führt oft zur Zerstörung anderer Eizellen.
   6. Hebe den oberen Objektträger (#2) vorsichtig an und ziehe eine seiner Ecken in die Mitte des mattierten Bereichs des unteren Objektträgers (#1), so dass sich die gerollten Eizellen in der Mitte des mattierten Bereichs ansammeln. Spülen Sie die Eizellen aus beiden Objektträgern mit PBSBTx in die Vertiefungsschale, die PBSBTx enthält.
   7. Reinigen Sie die Objektträger #1 und #2 mit Reinstwasser, trocknen Sie sie mit einem Einwegtuch und setzen Sie sie zurück. Die Schritte 1.3.1 - 1.3.6 wiederholen, bis alle Eizellen desselben Genotyps gerollt sind. Dies erfordert in der Regel 3 - 4 Wurfrunden pro Genotyp.
4. Entfernen Sie Schmutz nach dem Rollen
   1. Geben Sie 1 ml PBSBTx in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Schwenken Sie die Flüssigkeit, um die Seiten des Rohrs zu beschichten.
   2. Übertragen Sie die gerollten Eizellen mit einer PBSBTx-beschichteten P1000-Pipettenspitze aus der Vertiefungsschale in das konische Röhrchen mit 1 ml PBSBTx. Geben Sie weitere 2 ml PBSBTx in das konische Röhrchen mit den Eizellen.
   3. Lassen Sie die Eizellen beginnen, sich am Boden abzusetzen, entfernen Sie dann die oberen 2 ml der Lösung, die Ablagerungen (Chorionen, Vitelline usw.) enthält, mit einem P1000 und entsorgen Sie sie. Halten Sie den konischen Schlauch bei Bedarf vor einen dunklen Hintergrund, um die undurchsichtigen Eizellen beim Absinken zu sehen.
   4. Geben Sie weitere 2 ml PBSBTx in die Eizellen und wiederholen Sie Schritt 1.4.3. Wiederholen Sie 1.4.3. für insgesamt 3 Runden Schmutzbeseitigung.
   5. Übertragen Sie die Eizellen mit einer PBSBTx-beschichteten P1000-Pipettenspitze zurück in das ursprüngliche 500-μl-Mikrofuge-Röhrchen. 20 - 25 Frauen sollten etwa 50 μl gerollte reife Eizellen ergeben.
5. Wiederholen Sie Abschnitt 4 für die verbleibenden Genotypen mit frischen gefrosteten Objektträgern, einer sauberen Vertiefungsschale und einem neuen konischen Röhrchen für jeden Genotyp.
6. Falls eine Lagerung erforderlich ist, die Eizellen auf 1x PBS mit 0,1 % TritionX-100 umfüllen und über Nacht bei 4 °C lagern. Eine Langzeitlagerung wird nicht empfohlen, da die Formaldehydvernetzung durch nichtionische Detergenzien rückgängig gemacht werden kann.

Abbildung 1: Zytologie-Werkzeuge. Im Protokoll verwendete Werkzeuge: (1) Paar Pinzetten (#5 Dumont); (2) Wolframnadel; (3) Tiefbrunnenschale mit Deckel; (4) Sezierschale aus flachem Glas; (5) gezogene Pasteur-Pipette. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Anordnung und Bewegung der Objektträger für rollende Eizellen. (A) Diagramm des Objektträgers, der für das Rollen der Eizellen eingerichtet ist, wie im Protokoll beschrieben. Der dunklere Bereich kennzeichnet den Milchglasteil der Folie. (B) Richtung der Bewegungsvektoren für Objektträger #2 während des Rollens der Eizelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.