Dissektion des Auge-Hirn-Komplexes aus Fliegenpuppen: Eine Methode zur Isolierung von Netzhautgewebe

Abstract

Quelle: DeAngelis, M. W., Johnson, R. I. Dissektion der Pupal-Netzhaut von Drosophila für Immunhistochemie, westliche Analyse und RNA-Isolierung. J. Vis. Exp.(2019).

Dieses Video beschreibt, wie man den Auge-Hirn-Komplex aus Drosophila-Puppen präpariert und isoliert. Das vorgestellte Protokoll zeigt, dass das Verfahren qualitativ hochwertiges Gewebe liefert, das beispielsweise mit Immunfärbung und anderen Genexpressionsexperimenten kompatibel ist.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus DeAngelis und Johnson, Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation, J. Vis. Exp.(2019).

1. Vorbereitung des Gewebes

1. Richten Sie Drosophila-Kreuzungen ein (wie zuvor in Greenspan, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2004 beschrieben)) oder kulturspezifische Drosophila-Stämme, um Puppen des gewünschten Genotyps zu erhalten. Um sicherzustellen, dass eine große Anzahl von Puppen zufällig schlüpft, etablieren Sie diese Fliegenkulturen in doppelter Ausführung auf nährstoffreichen Nahrungsmedien oder Standardnahrungsmedien, die großzügig mit Hefepaste ergänzt werden.
2. Drosophila-Kulturen bei 25 °C halten. Für Kreuzungen mit dem UAS-GAL4-System ist GMR-GAL4 ein idealer Treiber, der in Larven-Augenscheibenzellen hinter der morphogenetischen Furche und während der gesamten Puppenentwicklung exprimiert wird. Die Kreuzung UAS-lacZ X GMR-GAL4 dient als ideale Kontrollkreuzung, da sie die Expression des nicht-endogenen und inerten β-Galactosidase-Proteins steuert.
3. Verwenden Sie die Spitze einer 6" Bambusschiene, die mit destilliertem Wasser angefeuchtet wurde, um weiße Vorpuppen (Abbildung 1B) vorsichtig von der Seite der gesunden Kulturfläschchen (Abbildung 1A) anzuheben und in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Abbildung 1C) zu legen.
4. Legen Sie die Röhrchen zusammen mit einem kleinen Stück in destilliertem Wasser getränktem Gewebe in eine Pipettenspitzenbox aus Kunststoff, um die Kammer auf ausreichender Feuchtigkeit zu halten und die Puppen vor Austrocknung zu schützen (Abbildung 1D). Inkubieren Sie die Puppen bei 25 °C bis zur Dissektion.
5. Verwenden Sie eine trockene 6-Zoll-Bambusschiene, um die Puppen vorsichtig aus dem Mikrozentrifugenröhrchen heraus und auf eine schwarze Präparierschale zu drücken. Lege ein frisches Stück doppelseitiges Klebeband auf die Sezierschale, weg von den Puppen.
6. Legen Sie mit einer Pinzette die Puppen mit der Rückenseite nach oben (d. h. das Operculum nach oben, Abbildung 1B) vorsichtig auf das Band (Abbildung 2A). Stellen Sie sicher, dass die Puppen gut auf dem Klebeband haften.
   HINWEIS: Feuchtigkeit auf der Puppenhülle verhindert eine sichere Haftung auf dem Klebeband, in diesem Fall lassen Sie die Puppen an der Luft trocknen, bevor Sie sie auf das doppelseitige Klebeband legen.

2. Dissektion von Auge-Hirn-Komplexen

1. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Operculum jeder Puppe zu entfernen (Abbildung 2C).
2. Verwenden Sie eine Mikrodissektionsschere, um die Puppenhülle jeder Puppe aufzuschneiden oder aufzuschneiden. Öffnen Sie die Puppenhülle, um den Kopf, den Thorax und das vordere Bauchsegment freizulegen, und befestigen Sie die Ränder der Puppenhülle am doppelseitigen Klebeband (Abbildung 2C).
   HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die Puppen vollständig freizulegen.
3. Durchstechen Sie den Bauch jeder Puppe mit einer scharfen Pinzette, um das Tier zu greifen, und entfernen Sie es aus seiner Puppenhülle (Abbildung 2C).
4. Legen Sie die Puppen auf die schwarze Sezierschale, weg vom Klebeband, und bedecken Sie sie mit etwa 400 μl eiskalter phosphatgepufferter Lösung (PBS, pH 7,4).
5. Fassen Sie jede Puppe mit einer Pinzette am Bauch und machen Sie mit einer Mikrodissektionsschere einen sauberen Querschnitt durch den gesamten Brustkorb und schneiden Sie die Puppe in zwei Hälften (Abbildung 2D).
6. Den hinteren Rest jedes Schlachtkörpers aus dem PBS entfernen und auf die Präparierschale legen (nicht wegwerfen, siehe Schritt 3.2.1).
7. Öffnen Sie mit zwei Paar feiner Pinzetten den Thorax und den Kopf jeder Puppe, um den Auge-Hirn-Komplex freizulegen (Abbildung 2E). Fassen Sie dazu die Schnittkanten des Thoraxepithels und reißen Sie nach und nach auf, um den Thorax und dann die Kopfkapsel zu öffnen, wodurch der Auge-Hirn-Komplex und das umgebende Fettgewebe freigelegt werden.
8. Ohne das Gewebe zu greifen, führen Sie den Auge-Hirn-Komplex mit einer Pinzette von den Resten der Kopfkapsel weg oder schöpfen Sie den Auge-Hirn-Komplex aus der aufgerissenen Kopfkapsel.
   HINWEIS: Der Auge-Hirn-Komplex ist hantelförmig, cremefarben und durchscheinender als das umgebende cremefarbene Fett (Abbildung 2B,E).
9. Entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig das meiste Fett, das mit den Auge-Hirn-Komplexen verbunden ist, ohne das Augengewebe zu berühren.

3. Verarbeitung von Gewebe für die Immunfluoreszenz

1. Mindestens 6-10 Puppen wie beschrieben (Schritte 2.1-2.9) präparieren.
   HINWEIS: Drei bis vier unabhängige Replikate jeder Dissektion liefern in der Regel genügend Daten, um eine Hypothese zu testen.
2. Waschen und Fixieren
   1. Schneiden Sie die Spitze einer P20- oder P100-Pipettenspitze mit einer sauberen Rasierklinge ab, um die Spitzenöffnung auf ~1 mm Radius zu vergrößern, und schmieren Sie, indem Sie eine Mischung aus PBS und Fett auf und ab pipettieren. Dieses Fett kann aus den in Schritt 2.6 entnommenen Schlachtkörperresten gewonnen werden.
   2. Übertragen Sie die Auge-Hirn-Komplexe in ~400 μl PBS in einer 9-Well-Glasschale auf Eis. Verwenden Sie die geschmierte Spitze und eine P20- oder P100-Luftverdrängungs-Mikropipette zum Übertragen.
      HINWEIS: Auge-Hirn-Komplexe haften beim Pipettieren an ungeschmierten Spitzen und werden beschädigt oder gehen verloren.
   3. Entfernen Sie das restliche Fett, das mit dem Augengewebe verbunden ist, indem Sie das PBS auf und ab pipettieren, um die Auge-Hirn-Komplexe sanft zu wirbeln. Pipettieren Sie bei diesem und allen folgenden Waschschritten Auge-Hirn-Komplexe nicht direkt auf und ab, da dies das empfindliche Augengewebe schädigt.
   4. Übertragen Sie die Auge-Hirn-Komplexe in einem minimalen Volumen (<20 μl) PBS in mindestens 250 μl Fixiermittel. Mischen Sie, indem Sie die Lösung auf und ab pipettieren. 35 min auf Eis inkubieren.
      HINWEIS: Für diesen Transfer kann die gleiche geschmierte Spitze verwendet werden, die in Schritt 3.1.1 vorbereitet wurde.
   5. Übertragen Sie die Auge-Hirn-Komplexe mit derselben Pipettenspitze in eine Vertiefung mit ~400 μl PBS. Mischen Sie, indem Sie die Lösung auf und ab pipettieren und 5-10 Minuten auf Eis inkubieren, um sie zu waschen. Wiederholen Sie den Waschvorgang mindestens zweimal.
      HINWEIS: Auge-Hirn-Komplexe können in der abschließenden PBS-Waschung mehrere Stunden lang auf Eis oder bei 4 °C gehalten werden, bevor mit Schritt 3.3.1 fortgefahren wird.
3. Antikörper-Färbung
   1. Um das Gewebe vor der Exposition gegenüber Antikörperlösungen zu blockieren, übertragen Sie die Auge-Hirn-Komplexe auf ~400 μl PBT. Verwenden Sie für den Transfer die geschmierte Spitze und eine P20 oder P100 Luftverdrängungs-Mikropipette. 10 bis 60 Minuten auf Eis inkubieren.
   2. Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung vor, indem Sie geeignete Antikörper in PBT verdünnen. Da Auge-Hirn-Komplexe in 10 μl Aliquoten der Antikörperlösung inkubiert werden, ist das vorbereitete Volumen ein Replikat von 10.
   3. Aliquotieren Sie 10 μl Antikörperlösung in eine saubere Vertiefung eines 72-Well-Mikrotiterplattens.
   4. Schneiden Sie die Spitze einer P10-Pipettenspitze mit einer sauberen Rasierklinge ab, um die Spitzenöffnung auf ~0,5 mm Radius zu vergrößern, und schmieren Sie sie, indem Sie PBT auf und ab pipettieren.
   5. Übertragen Sie nicht mehr als 5 Auge-Hirn-Komplexe in einem Volumen von <3 μl PBS in jede 10-μl-Vertiefung der Antikörperlösung unter Verwendung einer P10-Luftverdrängungs-Mikropipette und der geschmierten Spitze.
   6. Homogenisieren Sie die Antikörperlösung, indem Sie die Lösung auf und ab pipettieren. Pipettieren Sie die Auge-Hirn-Komplexe nicht auf und ab, da dies das Gewebe schädigt.
   7. Um die Verdunstung der Antikörperlösung zu minimieren, legen Sie ein kleines, in destilliertem Wasser getränktes Stück Gewebe in die Mikrotiterschale und verschließen Sie die Schale (z. B. mit dem mitgelieferten Deckel). Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   8. Übertragen Sie die Auge-Hirn-Komplexe aus der Mikrotiterschale in ~400 μl PBT in eine 9-Well-Glasschale, um sie zu waschen. Verwenden Sie eine P10-Luftverdrängungs-Mikropipette und eine PBT-geschmierte Spitze (bereiten Sie wie in Schritt 3.3.4 beschrieben vor). Mischen Sie, indem Sie die Lösung auf und ab pipettieren. 5-10 min auf Eis inkubieren.
   9. Wiederholen Sie den Waschschritt mindestens zweimal. Verwenden Sie eine P20- oder P100-Luftverdrängungs-Mikropipette und eine PBT-geschmierte Spitze, um die Auge-Hirn-Komplexe zwischen den Waschlösungen zu übertragen.
   10. Bereiten Sie die Sekundärantikörperlösung vor, indem Sie geeignete Fluorophor-markierte Sekundärantikörper nach Bedarf in PBT verdünnen. 100 μl Sekundärantikörperlösung sind ausreichend pro Charge von 6-10 Puppen. Aliquotieren Sie die sekundäre Antikörperlösung in eine 9-Well-Dissektionsschale aus Glas.
   11. Überführen Sie die Auge-Hirn-Komplexe in eine sekundäre Antikörperlösung. Verwenden Sie für den Transfer eine P20- oder P100-Luftverdrängungs-Mikropipette und eine PBT-geschmierte Spitze.
   12. Inkubieren Sie die Auge-Hirn-Komplexe in einer sekundären Antikörperlösung für 1-2 h bei Raumtemperatur oder 3-5 h bei 4 °C. Um ein Ausbleichen der Fluorophore durch Licht zu verhindern, das Präparat mit Folie abdecken.
       HINWEIS: Die optimale Dauer der Inkubation in einer Sekundärantikörperlösung kann je nach verwendetem Primär- und Sekundärantikörper unterschiedlich sein.
   13. Übertragen Sie die Auge-Hirn-Komplexe in ~400 μl PBT in eine 9-Well-Glasschale, um sie zu waschen. Mischen Sie, indem Sie die Lösung auf und ab pipettieren. 5-10 min auf Eis inkubieren. Dieser Waschschritt sollte mindestens zweimal wiederholt werden.
4. Sekundäre Fixierung
   1. Für eine sekundäre Fixierung werden die Auge-Hirn-Komplexe auf mindestens 200 μl Fixiermittel übertragen und 20 min bei Raumtemperatur oder 35 min bei 4 °C inkubiert.
      HINWEIS: Die sekundäre Fixation versteift das Augengewebe, was die Montage erleichtert (Schritt 3.5).
   2. Verwenden Sie eine P20- oder P100-Luftverdrängungs-Mikropipette und eine PBT-geschmierte Spitze, um Auge-Hirn-Komplexe in ~400 μl PBT in einer 9-Well-Glasschale auf Eis zu überführen und 5 Minuten lang zu waschen.
   3. Wiederholen Sie den Waschschritt mindestens einmal.
   4. Verwenden Sie eine P20- oder P100-Luftverdrängungs-Mikropipette und eine PBT-geschmierte Spitze, um die Auge-Hirn-Komplexe in ~400 μl PBS in einer 9-Well-Glasschale auf Eis zu übertragen und 1-2 Minuten lang zu spülen. Halten Sie das Gewebe in Bewegung, indem Sie PBS, aber nicht das Gewebe, auf und ab pipettieren, um zu verhindern, dass sich Auge-Hirn-Komplexe während der PBS-Spülung absetzen und an der Glasschale haften.
5. Montage
   1. Übertragen Sie die Auge-Hirn-Komplexe in ~200 μl Einbettmedien. Verwenden Sie eine P20- oder P100-Luftverdrängungs-Mikropipette und eine PBT-geschmierte Spitze, um die Auge-Hirn-Komplexe zu übertragen. Lassen Sie das Gewebe 1-2 h lang in Einbettmedien äquilibrieren.
   2. Geben Sie einen 5-8 μl Tropfen frisches Eindeckmedium auf einen sauberen Objektträger.
   3. Schneiden Sie eine P10-Spitze mit einer sauberen Rasierklinge ab, um die Spitzenöffnung auf ~0,5 mm Radius zu vergrößern, und verwenden Sie diese und eine P10-Luftverdrängungs-Mikropipette, um die Auge-Hirn-Komplexe in 5-8 μL Eindeckmedium in den Tropfen Eindeckmedium auf dem Objektträger zu übertragen.
   4. Verwenden Sie zwei Wolframnadeln, um die Augen von den Sehlappen zu trennen. Stecken Sie mit einer stabilen Wolframnadel einen Auge-Hirn-Komplex an den Objektträger und schneiden Sie jedes Auge mit einer feinen Wolframnadel vom zugehörigen Sehlappen ab (Abbildung 2F).
   5. Verwenden Sie die feine Wolframnadel, um jedes Auge an die Oberfläche des Objektträgers zu manövrieren, wobei die Grundfläche jedes Auges an den Objektträger angrenzt. Senken Sie einen sauberen Deckslip vorsichtig über das Taschentuch und befestigen Sie ihn mit Nagellack.
      HINWEIS: Die Anordnung der Augen auf dem Objektträger, so dass sie nahe beieinander oder in einer Linie liegen, erleichtert die anschließende Mikroskopie.
   6. Nehmen Sie die Netzhaut mit Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskopie ab.
      HINWEIS: Objektträger sollten bei 4 °C gelagert werden, wenn sie nicht sofort abgebildet werden.

Results

Abbildung 1: Selektion und Kultur von Puppen für die Dissektion. (A) Wandernde Larven und Puppen im dritten Larvenstadium (L3) befinden sich an den Seiten gesunder Drosophila-Kulturen. (B) Vorpuppen sind an ihrer durchscheinenden weißen Farbe zu erkennen, da das Pigment in der schützenden Puppenhülle noch nicht gebildet wurde. Die anterior-posteriore und die dorsal-ventrale A...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bambusschienen, 6"	Ted Pella Inc	Nr. 116
Schwarze Präparierschale			Petrischale aus Glas, die bis zum Rand mit SYLG170 oder SYLG184 gefüllt ist (schwarz gefärbt mit fein gemahlenem Holzkohlepulver). 24-48 h bei Raumtemperatur polymerisieren lassen.
Klingen-Halter	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Artikel-Nr.: 10053
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	Nr. A7906
Doppelseitiges Klebeband	3M	665
Drosophila & Nahrungsträger, nährstoffreich			7,5 % Saccharose, 15 % Glukose, 2,5 % Agar, 20 % Bierhefe, 5 % Pepton, 0,125 % MgSO4,7H2O, 0,125 % CaCl2,2H20
Drosophila & Lebensmittelmedien, Standard			Bloomington Drosophila Stock Center Maismehl Rezept. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Fixative Lösung			4% Formadehyd in PBS, pH 7,4.
Zange	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	91150-20	Die Pinzette sollte häufig geschärft werden.
Formaldehyd	Thermo Scientific	Artikel-Nr.: 28908
9-Well-Schalen aus Glas	Corning	7220-85	Auch bekannt als 9-Well-Gerichte
Glas-Deckgläser (22 x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542-B
Objektträger aus Glas (25 x 75 x 1 mm)	Fisher Scientific	Tel.: 12-550-413
Petrischale aus Glas	Corning	3160-100BO
Glycerin	Sigma-Aldrich	Nr. G5516
Mikrozentritur-Röhrchen	Axygen	MCT-175-C
Mikrodissektionsschere	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 15000-03
Mikrotiter-Trays (72 x 10 μl Wells)	Nunc	438733
Einhängemedien			0,5 % N-Propylgallat und 80 % Glycerin in PBS
N-Propylgallat	Sigma-Aldrich	Nr. P3130
PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4)	Sigma-Aldrich	Nr. P5368	Zubereitung nach Herstellerangaben
Pbt			0,15 % TritonX und 0,5 % Rinderserumalbumin in PBS, pH 7,4
Anstecknadel-Halter	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Artikel-Nr.: 26016-12
Primärer Antikörper: Ziegen-Anti-GAPDH	Imgenex	IMG-3073	Für Western Blotting. Verwendet bei 1:3000
Primärer Antikörper: Kaninchen-Anti-gespaltenes Dcp-1	Zelluläre Signalübertragung	9578S	Für Immunfluoreszenz. Verwendet bei 1:100
Primärer Antikörper: Ratte anti-DEcad	Entwicklungsstudien Hybridom-Bank	DCAD2	Für Immunfluoreszenz. Verwendet bei 1:20
Primärer Antikörper: Ratte anti-DEcad	DOI: 10.1006/dbio.1994.1287	DCAD1	Geschenk von Tadashi Uemura. Verwendet bei 1:100.
Skalpell-Klingen	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 10050	Brechen Sie ein kleines Stück der Scapel-Klinge ab und befestigen Sie sie im Klingenhalter.
Sekundärer Antikörper: 488-konjugiertes Esel-Anti-Ratten-IgG (H+L)	Jackson Immunforschung	Tel.: 712-545-153	Für Immunfluoreszenz. Verwendet bei 1:200
Sekundärer Antikörper: cy3-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)	Jackson Immunforschung	Tel.: 111-165-144	Für Immunfluoreszenz. Verwendet bei 1:100
Sekundärer Antikörper: HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Ratten-IgG (H+L)	Zell-Signaltechnik	7077	Für Western Blotting. Verwendet bei 1:3000
Sekundärer Antikörper: HRP-konjugiertes Kaninchen-Anti-Ziegen-IgG (H+L)	Jackson Immunforschung	Artikel-Nr.: 305-035-003	Für Western Blotting. Verwendet bei 1:3000
Stereo-Präpariermikroskop (M60 oder M80)	Leica Mikrosysteme		oder ähnliches Mikroskop
Sylgard (schwarz)	Dow Corning	SYLG170
Sylgard (transparent)	Dow Corning	SYLG184	Farbe schwarz mit fein gemahlenem Charcol-Pulver
Taschentuch: Kimwipes	KIMTECH	Artikel-Nr.: 34120
TritonX	Sigma-Aldrich	Nr. T8787
Wolframnadel, fein	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 10130-10	In den Stifthalter einsetzen
Wolframnadel, robust	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 10130-20	In den Stifthalter einsetzen
Hefepaste	(lokaler Supermarkt)		Ungefähr 2 Esslöffel Fleischmann's ActiveDry Hefe (oder ähnliches), gelöst in ~20 mL destilliertem H2O