Drosophila Dissektion des späten indirekten Flugmuskels (IFM): Eine Methode zur Gewebeentnahme mit hohem Durchsatz

Zusammenfassung

Quelle: Kao, S. Y., et al. Dissektion von Drosophila melanogaster Flugmuskeln für Omics-Anflüge. J. Vis. Exp. (2019).

Die Drosophila-Flugmuskeln werden als Modellsystem für Muskelentwicklung und Physiologie verwendet. Dieses Video beschreibt die Flugmuskulatur von Erwachsenen und zeigt ein Protokoll zur Dissektion der sich entwickelnden indirekten Flugmuskulatur, die für die RNA-Sequenzierung von Puppen geeignet ist.

Protokoll

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Kao et al., Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscle for Omics Approaches, J. Vis. Exp. (2019).

1. IFM-Dissektion nach 48 h APF

1. Stellen Sie die notwendige Ausrüstung zusammen, einschließlich zwei #5 Pinzetten in Biologiequalität, einer feinen Schere, Standard-Glasmikroskop-Objektträgern, Doppelklebeband, Pipette, Pipettenspitzen, Trockeneis und (für RNA-Anwendungen) Isolationsreagenz (siehe Materialtabelle). Kühlen Sie die 1x PBS und Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
2. Übertragen Sie die inszenierten Puppen mit einem leicht benetzten Pinsel auf einen Streifen doppelseitigen Klebebandes, der auf einem Objektträger befestigt ist (Abbildung 1A). Platzieren Sie die Puppen in einer Linie, die in der gleichen Ausrichtung ausgerichtet ist (ventral nach unten und anterior zum unteren Rand des Objektträgers).
   HINWEIS: Achte darauf, nicht zu viel Wasser auf den Pinsel oder Filter zu verwenden, sonst kleben die Puppen nicht gut. Wenn die Puppen nicht kleben, trocknen Sie sie, indem Sie sie zuerst auf einen trockenen Filter oder Seidenpapier geben. Montieren Sie so viele Puppen, wie innerhalb eines Zeitfensters von 30 Minuten präpariert werden können, idealerweise ~10 Puppen.
3. Nehmen Sie die Puppe aus der Puppenhülle. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Puppengehäuse über den vorderen Spiracles auseinander zu ziehen und zu öffnen (Abbildung 1B).
4. Schieben Sie eine Pinzette vorsichtig nach hinten und schneiden Sie die Puppenhülle durch, während sich die Pinzette bewegt (Abbildung 1B"). Achten Sie darauf, dass die darunter liegende Puppe nicht reißt. Befreien Sie die Puppe aus dem geöffneten Gehäuse und geben Sie sie sofort in einen Tropfen 1x PBS auf einen zweiten Objektträger (Abbildung 1B",C).
5. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 und 1.4 für alle Puppen in der Linie und legen Sie dann den Doppelklebebandschieber beiseite.
6. Schneiden Sie mit der feinen Schere den Hinterleib der Puppe vom Brustkorb ab und schieben Sie ihn in einen separaten Haufen (Abbildung 1D,D"). Wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen Puppen.
   HINWEIS: Beginnen Sie mit der Zeitmessung der Dissektionsdauer mit Schritt 1.6, sobald die Integrität der Puppe gestört ist. Zerlegen Sie so viele Fliegen wie möglich in 20–30 Minuten, um den Zelltod und die damit verbundenen transkriptomischen und proteomischen Veränderungen zu verhindern. Beim Präparieren von 1 d erwachsenen oder >90 h Puppen ist es für spätere Schritte oft praktisch, den Kopf zusätzlich mit der feinen Schere zu entfernen.
7. Entfernen Sie mit einem Seidenpapier den Großteil des 1x PBS (in der Regel trüb mit Schwebfett) sowie den Bauchhaufen (Abbildung 1E). Füge einen Tropfen frisches, gekühltes 1x PBS zu den restlichen Thoraxen hinzu.
8. Schneide den Thorax mit der Schere in zwei Hälften (Abbildung 1F,F'), indem du in einer einzigen Bewegung vom Kopf entlang der Körperlängsachse schneidest. Alternativ, wenn der Kopf entfernt wurde, führen Sie zuerst die Schere an der Stelle ein, an der der Kopf befestigt war, und schneiden Sie die obere Hälfte des Brustkorbs in Längsrichtung zwischen den IFMs ein. Schneiden Sie dann die ventrale Seite des Brustkorbs mit einem zweiten Schnitt in der gleichen Ausrichtung ab.
9. Wiederholen Sie die Schritte 1.7 und 1.8 für alle zu präparierenden Puppen, wobei ein Stapel von Thorax-Hemisektionen in der Nähe der Mitte des Objektträgers entsteht. Stellen Sie sicher, dass genügend gekühltes 1x PBS auf dem Objektträger vorhanden ist, damit die Halbkugeln nicht austrocknen.
   HINWEIS: Nach 48 h APF sind die IFMs groß genug, um unter einem Standard-Präpariermikroskop für das geschulte Auge sichtbar zu sein. An diesem Punkt des Protokolls können Muskeln mit einer Fluoreszenzmarkierung auf ein Fluoreszenz-Präpariergerät verschoben werden, um die IFM-Identifizierung zu erleichtern oder zu Trainingszwecken, dies ist jedoch nicht erforderlich.
10. Präparieren Sie die IFMs aus dem Thorax. Isolieren Sie eine der Hemisektionen mit der Pinzette #5 (Abbildung 1G,H). Führen Sie die Spitzen einer Pinzette vorsichtig über und unter der Mitte der IFMs ein (Abbildung 1G',H'). Während Sie die erste Pinzette ruhig halten, schneiden Sie mit einer feinen Schere ein Ende der IFM von der Nagelhaut und den Sehnen ab. Schneide dann das andere Ende des IFM von der Nagelhaut frei (Abbildung 1G'',H'').
    HINWEIS: Abhängig von der Ausrichtung des Thorax nach dem ersten IFM-Schnitt ist es sinnvoll, den Thorax um 180° zu drehen, damit der zweite IFM-Schnitt leichter durchzuführen ist.
11. Entfernen Sie das IFM-Bündel mit einer Pinzette (Abbildung 1G''',H'''' aus dem Thorax und übertragen Sie es an den Rand der PBS-Blase, um es mit Wasserspannung an Ort und Stelle zu halten (Abbildung 1I). Schiebe den Kadaver auf die gegenüberliegende Seite des Objektträgers. Wiederholen Sie dies für die verbleibenden Thorax-Hemisektionen, um eine Sammlung von präparierten IFMs zu erzeugen.
    HINWEIS: Wenn die IFMs nicht in einem ordentlichen Haufen bleiben, entfernen Sie einen Teil des 1x PBS mit einem Taschentuch. Achten Sie darauf, dass nicht das gesamte PBS verdunstet, und stellen Sie sicher, dass die präparierten IFMs und Hemithoraxe mit Puffer bedeckt bleiben.
12. Nachdem Sie alle IFMs präpariert haben, führen Sie schnell eine Qualitätskontrolle des präparierten Muskels durch. Entfernen Sie mit der Pinzette #5 alle Sprungmuskel- oder Nagelhautfragmente, die möglicherweise ihren Weg in die Probe gefunden haben (Abbildung 1J-K'').
    HINWEIS: Der Sprungmuskel sieht anders aus als IFM. Wenn der Mef2-Gal4-markierte Muskel unter Fluoreszenz präpariert wird, hat der Sprungmuskel eine schwächere Fluoreszenz und eine andere Form und Textur. Unter normalem Licht erscheint es fast durchscheinend, während die IFMs ein undurchsichtiges, milchiges Gelb haben (Abbildung 1J-J'',K).
13. Erfassen Sie die präparierten IFMs unter Verwendung von Wasserspannung zwischen einer Pinzette (Abbildung 1 L) (aber quetschen Sie sie nicht). Übertragen Sie die IFMs in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, das mit 250 μl gekühltem 1x PBS (Abbildung 1M) vorgefüllt ist. Fahren Sie sofort mit Abschnitt 2.
    fort. HINWEIS: Wenn die Pinzettenspitzen nahe beieinander gebracht und aus einer Pufferlösung gehoben werden, bewirkt die Wasserspannung, dass eine Pufferblase zwischen den Pinzettenspitzen gefangen wird. Befinden sich auch IFMs in dieser Blase, können diese aus der Lösung gehoben und einfach in einen anderen mit Puffer gefüllten Behälter überführt werden. Es ist wichtig, die Pinzette zusammenzudrücken, um die Spitzen nahe beieinander zu bringen, ohne sich zu berühren, um eine Mazeration des in der Pufferblase gefangenen Gewebes zu vermeiden.

2. Pelletieren und Konservieren der IFM-Probe

1. Pelletieren Sie die IFMs, indem Sie das 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen 3–5 Minuten lang bei 2.000 x g in einer Tischzentrifuge zentrifugieren (Abbildung 2A,B).
2. Entfernen Sie den Puffer mit einer Pipettenspitze (Abbildung 2C).
3. Für RNA-Anwendungen resuspendieren Sie das IFM-Pellet in 50–100 μl des gewünschten RNA-Isolationspuffers (siehe Materialtabelle, Abbildung 2D). Andernfalls fahren Sie mit Schritt 2.4.
   fort. HINWEIS: IFMs können nach Schritt 2.2 für massenspektrometrische Präparate oder die Isolierung von RNA mit kommerziellen Kits trocken eingefroren werden (siehe repräsentative Ergebnisse). Bei RNA-Anwendungen werden bessere Ergebnisse erzielt, indem das IFM-Pellet sofort resuspendiert und in Isolationspuffer eingefroren wird.
4. Probe auf Trockeneis einfrieren oder in flüssigem Stickstoff einfrieren (Abbildung 2E). Bei -80 °C lagern, bis sie für die nachfolgenden Schritte der Probenvorbereitung für die nachgelagerte Analyse bereit ist.
   HINWEIS: Nach der Kryokonservierung können die Proben mehrere Monate gelagert werden, bevor sie für die nachgelagerte Untersuchung verarbeitet werden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Dissektion von IFMs nach 48 h APF. (A) Ausrichten der Puppen auf Doppelklebeband. (B) Entnahme der Puppen aus der Puppenhülle durch Öffnen nach vorne, Durchtrennen der Hülle nach dorsal (B') und Herausheben der Puppe (B''). Die Kreissymbole stellen die gleichen dar wie in Abbildung 2. (C) Übertragung der ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
60 mm Kulturschalen	Sigma-Aldrich	Z643084-600EA	Greiner Schalen, 60 mm x 15 mM, belüftet
Handykamera, Samsung Galaxy S9	Samsung (Englisch)	SM-G960F/DS	Wird für Fotos verwendet, die nicht unter dem Mikroskop aufgenommen wurden
Doppeltes Klebeband	Scotch/3M	3M ID 70005108587	Doppelseitiges Klebeband, das bei den meisten Büromaterialhändlern erhältlich
Dumont #5 Pinzette	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11252-20	Inox-Pinzette mit gerader Spitze 11 cm, Biologie mit 0,05 mm x 0,02 mm Spitze
Kamera für Fluoreszenz-Präpariermikroskop, Leica DFC310 FX Kamera	Leica		www.leica-microsystems.com
Software für Fluoreszenz-Präpariermikroskope, Leica Application Suite (LAS) Version 4.0.0	Leica		www.leica-microsystems.com
Fluoreszierendes Präpariermikroskop, Leica M165 FC	Leica		www.leica-microsystems.com
Flug: Bru1[M2]			Fliegenstock; Dieses Papier
Fliegen: Bru1[M3]			Fliegenstock; Dieses Papier
Fliege: Mef2-GAL4	Bloomington Stock Center	BDSC:27390	Fliegen-Schaft
Fliege: salm[1]	Bloomington Stock Center	Artikel-Nr.: 3274	Fliegen-Schaft
Fliege: salm[FRT]			Fliegenbestand; siehe Spletter et al., Elife, 2018
Fliegen: UAS-Bru1IR	Drosophila-Forschungszentrum Wien	GD41568	Fliegenstock, RNAi-Haarnadel
Fliegen: UAS-GFP::GMA	Bloomington Stock Center	BDSC:31776	Fliegen-Schaft
Fliegen: UAS-mCD8a::GFP	Bloomington Stock Center	BDSC:5130	Fliegen-Schaft
Fliege: w[1118]	Bloomington Stock Center	3605	Fliegen-Schaft
Fliege: weeP26			Fliegenbestand; siehe Clyne et al., Genetics, 2003
GFP-Detektionsreagenz, GFP-Booster	ChromoTek	Nr. GBA488-100
Glykogen	Invitrogen	Tel.: 10814-010
Bildbearbeitungssoftware, Photoshop CS6	Lehmziegel		www.adobe.com
Isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516-25ML	2-Propanol
Methode 1 (RNA-Isolierung): TRIzol	Lebenstechnologien	15596018	Monophasische Lösung aus Guanidiniumisothiocyanat und Phenol
Methode 2 (RNA-Isolierung): Methode 1 + TURBO DNA-freies Kit	Invitrogen	AM1907	TRIzol-Isolierung, gefolgt von einer Behandlung mit einem Kit zur DNA-Entfernung
Methode 3 (RNA-Isolierung): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit	Zymo-Forschung	R2070S	RNA-Isolierung in TRIzol, aber über kommerzielle Säulen anstelle der Phasentrennung. Empfohlene DNase-Behandlung mit Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaktionspuffer.
Methode 4 (RNA-Isolierung): RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	Artikel-Nr.: 74134	Wir haben die bereitgestellte DNase-Behandlung verwendet. IFM-Pellets wurden in RTL-Puffer homogenisiert, wie es für tierisches Gewebe empfohlen wird.
Methode 5 (RNA-Isolierung): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System	Promega	Z6110	Wir haben das Protokoll für die "Aufreinigung von RNA aus fibrösem Gewebe" angewendet.
Methode 6 (RNA-Isolierung): Monarch Total RNA Miniprep Kit	Neuengland Biolabore	T2010G	Wir wandten das Protokoll für Gewebe/Leukozyten an und lysierten in 300 μl RNA-Schutzreagenz.
Mikrozentrifugen-Röhrchen	Thermo Fischer	AM12400	RNase-freie Mikrofuge-Röhrchen, 1,5 mL
Objektträger	Thermo Fischer	12342108	Standard-Schienen, ungeladen, 1 mm
Pinsel	Marabu	Artikel-Nr.: 1910000000	Marabu Fino Round No. 0, oder ähnlicher Pinsel aus beliebigem Künstlerbedarf
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	158127
PBS-Puffer (1x)	Sigma-Aldrich	Nr. P4417	Phosphatgepufferte Kochsalztabletten für 1 L Lösungen, pH 7,4
PFA PureTip Pipettenspitzen	Elementarwissenschaftlich	Artikel-Nr.: ES-7000-0101	Optionaler Ersatz für Standard-Pipettenspitzen zur Reduzierung von Probenverlusten; 100 ml, 0,8 mm Blende
Pipettenspitzen	Sigma-Aldrich	Nr. P5161	Universelle 200 mL Pipettenspitzen
RNA-Konzentration Ansatz 1 & RNA-Integritätsspuren, Bioanalysator	Agilent Technologien	G2939BA
RNA-Konzentration Ansatz 2, Nanotropfen	Thermo Fischer	ND-2000
RNA-Konzentration Ansatz 3, Qubit 4 Fluorometer	Invitrogen	Frage 33238
RNase A	Promega	Nr. A7937
RNasefreies Wasser, Diethylpyrocarbonat (DEPC)	Sigma-Aldrich	Nr. D5758	DEPC behandelt das Wasser über Nacht und autoklaviert es dann, um alle RNase zu entfernen.
RT Kit #1: Super Script III Reverse Transkriptase Kit	Invitrogen	Artikel-Nr.: 18080-044	Reverses Transkriptionskit
RT-Bausatz #2: LunaScript	Neuengland Biolabore	E3010S	Reverses Transkriptionskit
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transkriptionskit	Qiagen	Artikel-Nr.: 205410	Reverses Transkriptionskit
Statistik-Software: GraphPad Prism	GraphPad Prisma		www.graphpad.com
Statistik-Software: Microscoft Excel	Microsoft		Erworben als Teil des Bundles: Office Home & Student 2019
Tischzentrifuge	Eppendorf	5405000760	Eppendorf Zentrifuge 5425 oder gleichwertig
Taschentuch/ Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956	Standard-Taschentücher
Pipette übertragen	Sigma-Aldrich	Z350796	Pipette aus Kunststoff
Vannas Federschere	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Artikel-Nr.: 15000-00	3 mm Schneide, Spitzendurchmesser 0,05 mm, Länge 8 cm
Whatman-Papier	Sigma-Aldrich	Nr. 1004-070	Filterpapierkreise, Güteklasse 4, 70 mm

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