Drosophila In Vivo Calcium Imaging: Eine Methode zur funktionellen Bildgebung neuronaler Aktivität

Zusammenfassung

Quelle: Hancock, C. E., et al. In vivo Optische Kalziumbildgebung der lerninduzierten synaptischen Plastizität in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video beschreibt die In-vivo-Calcium-Bildgebung in Drosophila-Neuronen mit GCaMP. Der vorgestellte Protokollclip zeigt, wie Veränderungen der GCaMP-Fluoreszenz von Pilzkörperneuronen während eines olfaktorischen Konditionierungsexperiments aufgezeichnet werden können.

Protokoll

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Hancock et al., In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp.(2019).

1. In-vivo-Calcium-Bildgebung

1. Verwenden Sie ein Multiphotonenmikroskop, das mit einem Infrarotlaser und einem Wasserimmersionsobjektiv ausgestattet ist (siehe Materialtabelle), das auf einem schwingungsisolierten Tisch installiert ist. Für die Visualisierung von GFP-basierten Calciumindikatoren stimmen Sie den Laser auf eine Anregungswellenlänge von 920 nm ab und installieren einen GFP-Bandpassfilter.
2. Scannen Sie mit dem groben Z-Einstellknopf durch die Z-Achse des Gehirns und lokalisieren Sie die gewünschte Gehirnregion. Verwenden Sie die Zuschneidefunktion, um den Scanvorgang nur auf diesen Bereich zu fokussieren, um die Scanzeit zu minimieren, und um die Scanansicht so zu drehen, dass der vordere Teil des Kopfes nach unten zeigt.
3. Passen Sie die Framegröße auf 512 x 512 px an, die Scangeschwindigkeit auf > 4 Hz und den Scanbereich (in der Y-Dimension) so, dass die interessierenden Neuronen abgedeckt sind.

2. Visualisierung von geruchsevozierten Kalziumtransienten durch olfaktorische Konditionierung

1. Verwenden Sie ein Geruchsabgabesystem, das mehrere Geruchsreize zeitgenau abgeben kann.
   1. Verwenden Sie einen zusätzlichen Computer, um das Gerät zu steuern und mit der Software des bildgebenden Mikroskops zu kommunizieren, um Geruchsstimulationen mit der Bildaufnahme während der Experimente zu koordinieren.
   2. Initiieren Sie ein vorprogrammiertes Makropaket, das in der Lage ist, die Bildaufnahmesoftware und das Geruchsabgabeprogramm zu verknüpfen (z. B. ein VBA-Makropaket, das in der Mikroskopsteuerungssoftware installiert ist, siehe Materialtabelle), das auf einen externen Eingangsauslöser reagiert, der durch die Initiierung eines Geruchsabgabeprotokolls in einem separaten Programm bereitgestellt wird).
2. Beginnen Sie die Messung, indem Sie "Pre-Training"/naive geruchsevozierte Calciumtransienten bei einer Auflösung von 512 x 512 px und einer Bildrate von 4 Hz überwachen. Liefern Sie einen Geruchsstimulus von 2,5 s, flankiert von einer zusätzlichen Bildaufnahme für 6,25 s vor dem Geruchsbeginn (um einen F 0-Ausgangswert zu ermitteln) und 12,5 s nach dem Geruchsoffset. Wiederholen Sie dies mit einem zweiten Odorant und dann mit einem dritten Odorant.
3. Fahren Sie 3 min nach dieser Messung mit der klassischen Konditionierung ("Training") der Fliege fort.
   1. Wählen Sie einen der Gerüche aus, die in der "Vortrainingsphase" vorgestellt wurden, um zum CS⁺-Geruch zu werden, und einen anderen, um zum CS-Geruch zu werden. Präsentieren Sie den CS⁺ Geruch mit dem computergesteuerten Odor-Delivery-System für 60 s neben zwölf 90 V Elektroschocks.
   2. Nach einer Pause von 60 s ist der ^CS-Geruch 60 s lang allein zu halten. Als Geruchsstoffe sind 4-Methylcyclohexanol und 3-Octanol zu verwenden. Präsentieren Sie den dritten Geruchsstoff (z.B. 1-Octen-3-ol) während dieses Trainings nicht, da er nur vor (Schritt 2.2.) und nach (Schritt 2.4) der Trainingsphase als Kontrolle verwendet wird.
4. Messen Sie die geruchsevozierten Kalziumtransienten "nach dem Training" erneut, indem Sie das Geruchsstimulationsprotokoll "vor dem Training" (Schritt 2.2.) 3 min nach Beendigung der Trainingsphase (Schritt 2.3) wiederholen.
   HINWEIS: Der Zeitpunkt dieses Schritts sollte die interessierende Zeit nach der Gedächtnisbildung widerspiegeln (z. B. führen Sie diesen Schritt 3-4 Minuten nach dem Konditionierungsschritt durch, um das Kurzzeitgedächtnis zu untersuchen). Typischerweise können Fliegen in dieser Zubereitung mehrere Stunden überleben.
5. Speichern Sie Bilddateien in einem geeigneten Format (z. B. Tiff) für die spätere Bildanalyse.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. O5284	Chemikalie, die als Odorierungsmittel verwendet wird
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	218405	Chemikalie, die als Odorierungsmittel verwendet wird
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	153095	Chemikalie, die als Odorierungsmittel verwendet wird
Bandpassfilter für EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland
Mineralöl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	M8410	Wird als Verdünnungsmittel für Odoriermittel verwendet
Modengekoppelter Ti-Saphir-Laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, Kalifornien, USA		Abstimmbarer Infrarot-Femtosekundenlaser
Multiphotonenmikroskop LSM 7MP ausgestattet mit BiG-Detektoren	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland		Multiphotonenmikroskope, mehrere Unternehmen bieten ähnliche Geräte an.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1,0) Wasserimmersionsobjektiv	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland	Artikel-Nr.: 421452-9900-000	Objektiv W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Visual Basics of Applicatons (VBA)-Software, um einen Trigger von der Geruchsabgabevorrichtung und dem Elektroschock-Anwendungsgerät (Stromversorgung) zu erhalten, um mit der ZEN-Software von Zeiss zu interagieren, die das Mikroskop steuert	Individuell angefertigt und auf Anfrage erhältlich	n.a.	n.a.