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Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Gervaise und Arur, Räumliche und zeitliche Analyse des aktiven ERK in der C. elegans-Keimbahn. J. Vis. Exp.(2016).
>1. Zerlegung adulter Würmer zur Gewinnung von Gonaden
- Entnehmen Sie 100 - 150 WT (N2) oder den gewünschten Genotyp von Würmern im gewünschten und spezifischen Entwicklungsstadium (L1, L2, L3, L4, adult, etc.) in 100 μl M9-Puffer in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
- Füllen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit 900 μl M9-Puffer (siehe Materialtabelle). Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1.000 x g in einer Mikrozentrifuge für 1 min bei Umgebungstemperatur.
- Entfernen Sie vorsichtig 900 μl des M9-Puffers und entsorgen Sie ihn. Entfernen Sie den Puffer unter einem Präpariermikroskop, um sicherzustellen, dass die Würmer nicht versehentlich entfernt werden.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.2 - 1.3 noch zwei weitere Male mit jeweils frischem M9-Puffer. So wird sichergestellt, dass Bakterien, die mit den Würmern verschleppt wurden, effektiv weggespült werden.
- Entfernen Sie nach der letzten Wäsche 900 μl M9-Puffer aus dem Röhrchen und entsorgen Sie es.
- Die restlichen 100 μl M9-Puffer mit den 100 - 150 Würmern mit einer 200 μL-Mikropipettenspitze in eine Glasschale mit flachem Boden geben. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Mikropipette vor der Verwendung bei der 10-μl-Markierung geschnitten wird. Wenn die Spitze nicht abgeschnitten wird, werden die Würmer geschoren.
- 1 - 3 μl 0,1 M Levamisol in die Glasuhr geben, die die Würmer in M9-Puffer enthält. Schwenken Sie das Levamisol und den M9 vorsichtig, um ein gleichmäßiges Mischen zu ermöglichen, bis sich die Würmer nicht mehr bewegen.
HINWEIS: Levamisol-Bestände können bei -20 °C gelagert werden, um sie langfristig zu lagern. Verwenden Sie hier die höhere Konzentration von 1 - 3 mM als in der Literatur23 beschrieben von 0,2 - 0,25 mM Levamisol, um einen schnellen Verlust der Beweglichkeit bei den Tieren zu erreichen. Wenn sich die Tiere zu lange in der flüssigen Suspension häuten, können die resultierenden Muster von dpERK in den Gonaden variabel sein (aufgrund von Stress oder mangelnder Ernährung oder beidem). Reproduzierbare Färbemuster wurden mit 1 - 3 mM Levamisol für die Dissektion erzielt.
- Befestigen Sie zwei 25-G-Nadeln an zwei 1-ml-Spritzen (die Größe der Spritze spielt keine Rolle, die Stärke der Nadel ist entscheidend). Positionieren Sie eine Spritze in jeder Hand (Abbildung 1).
- Positionieren Sie unter einem Präpariermikroskop jede Nadel unter und über jedem Wurm, wie in Abbildung 1 gezeigt, und platzieren Sie einen feinen Schnitt in einer scherenartigen Bewegung auf dem Wurm in der Nähe des zweiten Rachenknollen. Nach einem Schnitt in den Wurm geht es weiter zum nächsten Tier, bis alle Tiere in der Schale mindestens einmal geschnitten wurden.
HINWEIS: Beachten Sie, dass die Schritte 1.8 - 1.9 zeitkritisch sind. Präparieren Sie alle Würmer in der Schale in weniger als fünf Minuten, um ein reproduzierbares dpERK-Muster zu erhalten. Längere Präparierzeiten führen zu einer Abschaltung des dpERK-Signals, insbesondere in Zone 1. Passen Sie die Anzahl der Würmer pro Dissektionsrunde an (z. B. 50 Würmer vs. 150), falls erforderlich, um im vorgegebenen Zeitrahmen zu bleiben.
- Falls eine extrudierte Gonade während der Dissektion nicht sichtbar ist, versuchen Sie keinen weiteren Schnitt am selben Tier. Normalerweise wird das Tier dadurch nur geschoren und es kommt nicht zu einer Extrusion der Gonade. Gehen Sie stattdessen zum nächsten Tier über. Würmer, bei denen die Gonaden nicht extrudieren, erscheinen als solche auf den Objektträgern, die in Abschnitt 6 erstellt werden, und können während der Bildgebung ignoriert werden
HINWEIS: Bei allen Präparier- und Verarbeitungsschritten ist zu beachten, dass die Gonade am Körper/Kadaver haftet. Drücke die Keimdrüse und den Körper nicht mit der Nadel auseinander. Oft kann ein abnormaler Riss im Gonadengewebe bei dem Versuch, die Gonade vom Körper zu trennen, zu einem falschen Antikörpersignal führen. Der Körper/Kadaver kann während der Bildgebungsschritte ignoriert und nur die Keimdrüse abgebildet werden. Darüber hinaus können die Darmzellen manchmal auch als interne Kontrollen/somatische Kontrollen für den zu testenden Antikörper dienen.
Abbildung 1: Demonstration der Nadelpositionen während der Dissektion. Links: Foto einer laufenden Sektion. Rechts: Nadelpositionen in Bezug auf die Schnecke. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
