Einzelwurm-PCR: Eine Methode zur Extraktion und Amplifikation genomischer DNA

Zusammenfassung

Quelle: Prior, H., et al. Eine schnelle und einfache Pipeline zur Generierung genomischer Punktmutanten in C. elegans unter Verwendung von CRISPR/Cas9-Ribonukleoproteinen.J. Vis. Exp.(2018).

Dieses Video beschreibt eine Technik, um einen einzelnen Nematoden durch PCR-Screening schnell auf einen genetischen Marker zu untersuchen. Im Beispielprotokoll untersuchen wir die CRISPR-basierte Genom-Editierung.

Protokoll

Das folgende Protokoll ist ein Auszug aus Prior et al., A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).

Einzelwurm-PCR und Genotypisierung

1. Nach 1 - 2 Tagen der Eiablage werden die F₁s mit einem Wurmpickel in einzelne PCR-Streifenröhrchenkappen mit 7 μl Wurmlysepuffer überführt (Tabelle 1, Abbildung 1D, Tag 4 - 5).
2. Zentrifugieren Sie PCR-Röhrchen 1 Minute lang bei maximaler Drehzahl bei Raumtemperatur, um die Tiere auf den Röhrchenboden zu bringen, und frieren Sie die Röhrchen bei -80 °C für 1 h.
   HINWEIS: Würmer können unbegrenzt bei -80 °C gelagert werden.
3. Lysieren Sie gefrorene Würmer in einem Thermocycler mit folgendem Programm: 60 °C für 60 min, 95 °C für 15 min, 4 °C halten.
4. Richten Sie den PCR-Mastermix ein, wie in Tabelle 2 gezeigt.
5. Geben Sie 21 μl PCR-Mastermix in saubere PCR-Röhrchen und fügen Sie dann 4 μl Wurmlyse aus Schritt 3 hinzu. Mit einer Pipette gut mischen und das PCR-Programm gemäß den Richtlinien des Herstellers durchführen (siehe Materialtabelle).
6. Aufreinigen Sie PCR-Reaktionen mit einem DNA-Reinigungs- und Konzentrat-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Eluieren Sie die DNA, indem Sie 10 μl Wasser in die Spin-Säule geben.
7. Setup-Restriktionsenzym-Mastermix, wie in Tabelle 3 gezeigt.
8. Geben Sie 10 μl des Restriktionsenzym-Mastermixes zu jeder gereinigten PCR-Reaktion und inkubieren Sie 1 - 2 h bei 37 °C.
9. Trennen Sie verdaute PCR-Produkte auf einem 1,5%igen Agarosegel, das bei 120 V unter Verwendung von 1x Tris-Acetat-EDTA (TAE)-Puffer betrieben wird.

Ergebnisse

Abbildung 1. CRISPR-Cas9-Engineering des C. eleganssod-1-Locus. (A) Schematische Darstellung der Exon-Intron-Struktur des sod-1-Locus in C. elegans. Der rote Balken zeigt die Position von G93 im Exon 3 an. Das Zündhütchenpaar ist durch die roten Pfeile (F1-R1) gekennzeichnet. (B) Sequenzausrichtung von human...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Nukleasefreies Wasser	Synthego Inc.	bereitgestellt mit dem sgRNA-Kit EZ kit
KCl	Sigma	Nr. P5405
DNA Clean & Concentrator	Zymo-Forschung	Nr. D4004
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit	Zymo-Forschung	Nr. D4002
Q5 Heißstart High-Fidelity 2X Master Mix	Neuengland Biolabore	M0494L
Proteinase K	Sigma	Nr. P2308
MgCl2	Sigma	Nr. M2393
NP-40	Sigma	Artikel-Nr.: 74385
Tween-20	Fisher Scientific	Nr. BP337-100
RNaseZap Dekontaminationslösung	Fisher Scientific	AM9780