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Abstract

Quelle: Escorcia, W., et al. Quantifizierung der Lipidhäufigkeit und Bewertung der Lipidverteilung bei Caenorhabditis elegans durch Nilrot- und Ölrot-O-Färbung. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Färbung von Lipiden in ganzen, fixierten Würmern mit dem Farbstoff Nilrot. Um speziell die neutralen Lipide im Kern von Lipidtröpfchen zu betrachten, stellen Sie sich die grünen Emissionsspektren der gefärbten C. elegans vor.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Escorcia et al., Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining, J. Vis. Exp. (2018).

<p class="jove_title">1. Nilrot (NR) Färbung von Lipiden

1. Herstellung von 5 mg/mL NR-Stammlösung
   1. In einer 500-ml-Flasche 100 mg NR-Pulver zu 200 ml 100 % Aceton hinzufügen.
   2. Decken Sie die Flasche mit Alufolie ab, um jegliche Lichteinwirkung zu vermeiden.
   3. Rühren Sie die Lösung vor Gebrauch 2 h im Dunkeln um.
   4. Lagern Sie die NR-Stammlösung für den Langzeitgebrauch in einer dicht verschlossenen Flasche ohne jegliche Lichteinwirkung. Skalieren Sie die NR-Stammlösung entsprechend den Forschungsanforderungen. Stellen Sie sicher, dass bei allen NR-Färbeexperimenten dieselbe Stammlösung verwendet wird, um konsistente Färbe- und Bildgebungsergebnisse zu erhalten.
2. Herstellung der NR-Arbeitslösung
   1. Pro 1 ml 40 % Isopropanol (v/v) werden 6 μl NR-Stammlösung zugegeben.
   2. Bereiten Sie 600 μl NR-Arbeitslösung für jede Probe vor.
      HINWEIS: Stellen Sie kurz vor dem Färben eine frische NR-Arbeitslösung her. Je nach Bedarf an NR-Stammlösung können Sie entweder ein konisches 15-ml- oder ein 50-ml-Messrohr verwenden.
3. Vorbereitung von Würmern für die NR-Lipidfärbung
   1. Züchten Sie die Würmer bis zum frühen L4-Stadium bei 20 °C auf Nematoden-Wachstumsmedium (NGM), das mit OP50 E. coli aus dem späten Logarithmus besät wurde.
   2. Waschen Sie die Würmer von der Platte mit 1 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung + 0,01 % Triton X-100 (PBST) Lösung und geben Sie die Wurmsuspension in ein 1,5 ml Mikrofugenröhrchen.
   3. Die Würmer werden bei 560 x g 1 Minute lang zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie diesen Schritt, bis E. coli aus der Suspension entfernt ist.
   4. Geben Sie 100 μl 40% Isopropanol zum Wurmpellet und inkubieren Sie es 3 Minuten lang bei Raumtemperatur.
   5. Die Würmer bei 560 x g 1 min zentrifugieren und den Überstand entfernen, ohne das Wurmkorn zu beschädigen.
      HINWEIS: Verwenden Sie größere Mengen PBST, um die Würmer von den Platten zu waschen, wenn Sie größere Platten verwenden oder mehr Würmer pro Platte färben. Waschen Sie die Würmer nicht länger als 15 Minuten vor der Probenfixierung in PBST. Führen Sie weitere Wäschen durch, wenn der Überstand nicht von Bakterien befreit ist. Führen Sie die Inkubation in 40% Isopropanol mit einem Nutator oder einer Wippe durch. Überwachen Sie die Röhrchen immer, um sicherzustellen, dass die Probe vollständig bewegt wird.
4. Lipidfärbung mit NR
   1. Geben Sie im Dunkeln 600 μl NR-Arbeitslösung zu jeder Probe. Drehen Sie die Röhrchen dreimal um und mischen Sie die Würmer vollständig in NR-Lösung.
   2. Drehen Sie die Probe 2 Stunden lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.
   3. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Würmer 1 min lang bei 560 x g und entfernen den Überstand.
   4. Fügen Sie 600 μl PBST hinzu und inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang im Dunkeln, um überschüssige NR-Flecken zu entfernen.
   5. Die Proben werden 1 min lang bei 560 x g zentrifugiert und alle bis auf etwa 50 μl Überstand entfernt.
      HINWEIS: Bei der NR-Inkubation ist kein Rühren erforderlich. Das Absetzen von Würmern ist bei diesem Schritt üblich.
5. Vorbereitung von Objektträgern für die mikroskopische Bildgebung
   1. Suspendieren Sie das Wurmpellet wieder in den verbleibenden Überstand.
   2. Geben Sie 5 μl Wurmsuspension auf einen Objektträger und legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf, um Luftblasen zu vermeiden.
   3. Versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack, bevor Sie Würmer abbilden.
   4. Bereiten Sie jeweils nur ein paar Folien vor. Dadurch wird sichergestellt, dass die NR-Bildgebung über alle Proben hinweg konstant bleibt. Die Qualität von NR-gefärbten Bildern nimmt nach 6 h ab. Diskrete Lipidtröpfchen sind schwer zu beobachten und die Hintergrundfluoreszenz nimmt zu, was die Erkennung des NR-Signals beeinträchtigt.
6. Bildgebung von NR-gefärbten Würmern
   1. Bilde die Würmer mit 5-facher Vergrößerung, um mehrere Tiere pro Sichtfeld zu erfassen.
   2. Wechseln Sie zur 10-fachen Vergrößerung für eine bessere Quantifizierung einzelner Würmer.
   3. Verwenden Sie den FITC/GFP-Kanal, um NR-gefärbte Würmer abzubilden, und probieren Sie verschiedene Belichtungszeiten aus, um die optimalen Bedingungen für die Quantifizierung zu bestimmen.
   4. Speichern Sie Dateien im TIF-Format, um Datenverluste durch Komprimierung zu vermeiden.
      HINWEIS: Typische Belichtungszeiten liegen zwischen 100 und 1000 ms. Verwenden Sie es bei optimaler Belichtungszeit für alle Proben, um die Bildkonsistenz zu erhalten.

Materials

Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator