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Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Germany et al, Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp.(2019).
>1. Vorbereitung und Sammlung von gealterten Würmern für die Zellisolierung
HINWEIS: Im Folgenden wird die Isolierung von cholinergen Neuronen aus dem transgenen unc-17::GFP-Stamm (OH13083) erläutert, der aus dem Stammdepot des Caenorhabditis Genetics Center (CGC) an der University of Minnesota gewonnen wurde. Es ist zwingend erforderlich, sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten, um eine Kontamination durch Pilze oder Bakterien zu verhindern.
- Bereiten Sie die Würmer vor und synchronisieren Sie sie mit der Bleichmethode, wie sie von T. Stiernagle beschrieben wird. Für Alterungsexperimente werden Plattenwürmer auf Nematoden-Wachstumsmedium (NGM)-Platten mit 25 μM wässriger Lösung von Fluordesoxyuridin (FuDR) aufgebracht, um die Eiproduktion zu reduzieren und das Schlüpfen der Eier zu stoppen. Kontrollieren Sie die Agarplatten regelmäßig, um eine Kontamination oder das Schlüpfen von Eiern zu verhindern, da dies zu unzuverlässigen Ergebnissen führt.
HINWEIS: Für unc-17::GFP-Zellen werden typischerweise drei 100 mm x 15 mm große NGM-Platten verwendet, um eine ausreichende Anzahl von Zellen von Interesse zu isolieren.
- Sammeln Sie Würmer und bereiten Sie Puffer für die Zellisolierung vor.
- Sammeln Sie die Würmer in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Die Würmer aus der Platte mit 1,5 mL M9-Puffer (1 mM MgSO4, 85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO, pH 7,0) waschen und 5 min bei 1.600 x g zentrifugieren. Überstand verwerfen und Würmer mit 1 ml M9-Puffer waschen. Wiederholen Sie das Zentrifugieren und Waschen insgesamt fünfmal, um so viel E. coli-Kontamination wie möglich zu entfernen.
HINWEIS: Die Zugabe von Antibiotika (50 μg/ml) wie Ampicillin in diesem Schritt kann dazu beitragen, die bakterielle Kontamination zu reduzieren.
- Bereiten Sie für zwei Proben 2 ml Natriumdodecylsulfat-Dithiothreitol (SDS-DTT)-Lysepuffer vor: 200 mM DTT, 0,25 % (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8,0) und 3 % (w/v) Saccharose.
- Bereiten Sie 15 mL Isolationspuffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES [pH 7,3]) vor und lagern Sie ihn auf Eis.
HINWEIS: Sowohl der SDS-DTT-Lysepuffer als auch der Isolationspuffer müssen vor jedem Experiment frisch gemacht werden.
- Nagelhautaufschluss und Einzelzellisolierung
- Die in Schritt 1.2.1 gesammelten Tiere werden 5 min lang bei 1.600 x g zentrifugiert. Entfernen Sie alle Überstände und suspendierten Würmer in 1 ml M9-Medium und geben Sie sie in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Pelletschnecken mit Zentrifugation bei 1.600 x g für 5 min.
- Geben Sie 200 μl SDS-DTT-Lysepuffer zu den Würmern und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT). Würmer sollten am Körper entlang "gewunden" erscheinen, wenn man sie unter einem Lichtmikroskop betrachtet.
HINWEIS: Eine längere Exposition gegenüber SDS-DTT-Lysepuffer kann zum Tod von Würmern führen, was durch Beobachtung von Würmern überwacht werden kann. Würmer, die tot sind, verlängern sich und kräuseln sich nicht.
- 800 μl eiskalten Isolationspuffer hinzufügen und durch leichtes Bewegen des Röhrchens mischen.
- Pellet-Würmer für 1 min bei 13.000 x g bei 4 °C, Überstand entfernen und mit 1 mL Isolationspuffer waschen.
- Wiederholen Sie Schritt 1.3.5 insgesamt fünfmal und entfernen Sie dabei jedes Mal vorsichtig den Isolationspuffer.
- Geben Sie 100 μl Proteasemischung aus Streptomyces griseus (15 mg/ml) (Materialtabelle), gelöst in Isolationspuffer, in das Pellet und inkubieren Sie es 10-15 min lang bei RT.
HINWEIS: Wie beim SDS-DTT-Lysepuffer kann der verlängerte Proteaseverdau zu einer übermäßigen Spaltung von Proteinen entlang der Plasmamembran führen, wodurch die Isolierung von oberflächenexponiertem GFP über magnetische Beads verhindert wird.
- Während der Inkubation mit der Proteasemischung wenden Sie eine mechanische Disruption an, indem Sie die Proben mit einer 200-μl-Mikropipettenspitze ~60-70 Mal auf und ab gegen den Boden des 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens pipettieren. Halten Sie die Pipettenspitze mit konstantem Druck an die Wand des Mikrozentrifugenröhrchens, um die Zellen richtig zu trennen.
- Um das Stadium des Aufschlusses zu bestimmen, entnehmen Sie ein kleines Volumen (~1-5 μL) des Aufschlussgemisches, lassen Sie es auf einen Objektträger fallen und untersuchen Sie es mit einem Gewebekulturmikroskop. Nach 5-7 min Inkubation sollten die Wurmfragmente eine sichtbar reduzierte Kutikula aufweisen und ein Zellschlamm ist deutlich sichtbar.
- Stoppen Sie die Reaktion mit 900 μl kommerziell erhältlichem kaltem L-15-Medium von Leibovitz, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration bei 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin).
- Isolierte Fragmente und Zellen werden durch Zentrifugation für 5 min bei 10.000 x g bei 4 °C pelletiert. Waschen Sie die pelletierten Zellen noch zweimal mit 1 mL kaltem, mit L-15 supplementiertem Medium, um sicherzustellen, dass überschüssige Ablagerungen und Nagelhaut entfernt werden.
- Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in 1 mL L-15-supplementiertem Medium und lassen Sie sie 30 Minuten lang auf Eis. Nehmen Sie die oberste Schicht, ca. 700-800 μl, in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Diese Schicht enthält Zellen ohne Zelltrümmer und wird bei der anschließenden Isolierung von Zellen von Interesse verwendet.
- Verwenden Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers einen automatisierten Zellzähler oder ein Hämozytometer, um die Zelldichte von 10-25 μl isolierter Zellen zu messen.