Ethanolfixierung und DAPI-Färbung: Eine Methode zur Visualisierung von DNA in C. elegans

Zusammenfassung

Quelle: Clarke, E. K., et al. Manipulation der Ploidie bei Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).

Hier beschreiben wir eine Technik, die zur Visualisierung genomischer DNA in fixierten, intakten Nematoden verwendet wird. Das Video enthält ein Beispielprotokoll zur Zählung von Chromatin in unbefruchteten C. elegans-Eizellen.

Protokoll

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Clarke et al., Manipulation der Ploidie bei Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).

Tetraploide Stämme können validiert werden, indem die Anzahl der Chromosomen in ihren unbefruchteten Eizellen gezählt wird. Die Fluoreszenzmikroskopie kann verwendet werden, um die Anzahl der Chromosomenpaare in unbefruchteten diploiden Eizellen (vor der meiotischen Teilung) zu untersuchen, wenn der Stamm einen fluoreszierenden Marker für Chromosomen hat. In Ermangelung fluoreszierender Chromosomenmarker können tetraploide Nematoden gescreent werden, indem die Nematoden fixiert und mit einem DNA-Farbstoff gefärbt werden. Nachfolgend finden Sie ein Protokoll für die Ethanolfixierung und die Färbung von 4′,6-Diamidin-2′-phenylindoldihydrochlorid (DAPI) bei ganzen Tieren.

DAPI-Färbung bei ganzen Tieren

HINWEIS: Tetraploide Stämme mit 12 verbundenen Chromosomenpaaren können validiert werden, indem diese Tiere mit DAPI gefärbt und die Anzahl der DAPI-Körper in ihren unbefruchteten Eizellen gezählt werden.

1. Geben Sie 5 bis 10 μl M9-Puffer auf einen Objektträger und übertragen Sie dann 6 - 10 Nematoden auf den Tropfen.
2. Ziehen Sie unter einem Präpariermikroskop den größten Teil des M9 aus dem Tropfen, ohne die Nematoden mit einem fusselfreien Reinigungstuch zu entfernen. Geben Sie dann sofort einen 10-μl-Tropfen 90%iges Ethanol auf die Würmer. Lasse die Würmer vollständig trocknen, aber nicht länger als ein paar Sekunden.
3. Sobald das Ethanol verdampft ist (dies ist unter dem Präpariermikroskop zu sehen), geben Sie weitere 10 μl 90%iges Ethanol auf die Würmer.
4. Wiederholen Sie Schritt 3.1.3 noch dreimal.
5. Sobald der letzte Tropfen Ethanol verdampft ist, fügen Sie 6 μl DAPI- oder Hoechst-Farbstoff in der empfohlenen Endkonzentration in das Einbettmedium Ihrer Wahl hinzu (z. B. eine 1:1.000-Verdünnung einer DAPI-Stammkonzentration von 2 ng/μl in M9). Für die Langzeitlagerung der Objektträger kann 0,5 % p-Phenylendiamin, gelöst in 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, in 90 % Glycerin als Antifading-Lösung, anstelle von M9 allein verwendet werden.
6. Decken Sie die Würmer auf dem Deckglas mit einem Deckglas ab und versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit Nagellack. Stechen Sie mindestens 10 Minuten nach dem Hinzufügen des Deckglases in einem Fluoreszenzmikroskop (Schritt 3.1.7). Objektträger ohne Antifading können vor dem Ritzen einige Tage bei 4 °C gelagert werden, aber die Qualität der Fluoreszenz beginnt nach einigen Tagen nachzulassen.
7. Bewerten Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 100-facher Vergrößerung die Anzahl der einzelnen DAPI-Körper (vermutlich einzelne Chromosomenpaare) in der reifsten unbefruchteten Eizelle, die unmittelbar an die Spermathek angrenzt und noch nicht in die Spermathek oder die Gebärmutter eingedrungen ist.
   1. Um einzelne DAPI-Körper innerhalb eines Eizellkerns zu bewerten, verwenden Sie den Feinfokus des Mikroskops, um sich während der Zählung langsam von der Spitze des Eizellkerns nach unten zu bewegen. Zählen Sie dann denselben Kern neu, während Sie den Fokus in die entgegengesetzte Richtung bewegen (d. h. von unten nach oben im Kern), um die gezählte Anzahl von DAPI-Körpern zu bestätigen.
8. Ermitteln Sie die reifste unbefruchtete Eizelle in jeder der beiden Gonaden in mindestens zehn Hermaphroditen pro stabilem Lon-Stamm. Wildtyp-Eizellen haben im Durchschnitt 6 DAPI-Körper, 5 Autosomenpaare und das Geschlechtschromosomenpaar. Das Vorhandensein von 12 DAPI-Körpern in der Eizelle stabiler Lon-Stämme deutet darauf hin, dass die Tiere in diesem Stamm entweder partiell (4 Sätze Autosomen, 3 X-Chromosomen) oder vollständige (4 Sätze Autosomen, 4 X-Chromosomen) tetraploide sind.
9. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl von DAPI-Körpern, die aus mehreren (mindestens 10) Eizellen pro Stamm beobachtet wurden. Einige Chromosomenpaare berühren sich oder liegen direkt übereinander, so dass die Anzahl der DAPI-Körper in einer Eizelle oft kleiner ist als die tatsächliche Anzahl der Chromosomenpaare.
10. (Optional) Weitere Validierung stabiler Lon-Stämme, bei denen die durchschnittliche Anzahl von DAPI-Körpern 12 beträgt, um zu testen, ob es sich um vollständige (4A, 4X) oder partielle (4A, 3X) Tetraploide handelt, indem Immunfluoreszenzfärbung gegen Chromosomenachsenproteine wie HTP-3 erfolgt. Diese Färbung unterscheidet Chromosomenpaare, indem sie ein kreuzförmiges Muster von einzelnen unverbundenen Chromosomen zeigt, die im partiellen Tetraploid vorhanden sind.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Präpariermikroskop	Motische Mikroskopie	SMZ171
Name	Firma	Katalognummer	Kommentare
Färben
Hoechst 33258, Pentahydrat	Biotium	40045
DAPI	Biotium	40011
Name	Firma	Katalognummer	Kommentare
Ethanol-Fixierung
Ethanol, rein, 190 Proof (95%), USP	Koptec, VWR	Tel.: 89125-166
Name	Firma	Katalognummer	Kommentare
M9 Puffer
Natriumchlorid, biotechnologische Qualität	VWR	Artikel-Nr.: 97061-278
Kaliumphosphat, monobasisch wasserfrei	VWR	Tel.: 97062-346
Natriumphosphat, einbasisches Dihydrat	Fisher Scientific	AC271750025