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Das folgende Protokoll ist ein Auszug aus Kudumala et al., Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp.(2019).
SWIP
HINWEIS: Wir beschreiben die manuelle Methode zur Bewertung von SWIP bei Wildtyp-Würmern, die mit AMPH behandelt wurden. Wir diskutieren auch kurz das Tracking von Würmern und die weitere Analyse der Wurmkinetik mit Hilfe eines automatisierten Wurmtrackers und einer Tracking-Software, die zuvor von Hardaway et al. beschrieben wurden.
- Manuelle Methode zum Testen auf SWIP
- Aliquot 40 μl 200 mOsm/L Saccharoselösung entweder mit oder ohne 0,5 mM AMPH in eine Glasspotplatte. Entnehmen Sie unter dem Stereoskop 8-10 Würmer des späten L4-Stadiums mit einem Wimpern- oder Platinpickel und tauchen Sie das Plektrum in die Platte mit der Lösung, bis sich die Würmer vom Plektrum lösen und in die Lösung schwimmen. Notieren Sie sich die Anzahl der Würmer, die in die Vertiefung gepickt wurden, starten Sie den Timer, beobachten und notieren Sie die Anzahl der Würmer, die bei jeder Minutenmarke SWIP zeigen.
- Kopieren Sie die Rohdaten in eine Tabelle und berechnen Sie den Prozentsatz der gelähmten Würmer, indem Sie die Anzahl der Würmer, die pro Minute gelähmt sind, durch die Gesamtzahl der während des Assays getesteten Würmer dividieren und mit 100 multiplizieren. Kopieren Sie die Prozentwerte in eine beliebige Grafik- und Statistiksoftware und zeichnen Sie die Daten mit Prozentwerten auf der Y-Achse und Zeit auf der X-Achse im XY-Diagrammformat.
- Führen Sie eine bidirektionale ANOVA durch, gefolgt von einer Post-hoc-Analyse (z. B. Bonferroni-Nachtest), um die statistische Signifikanz zwischen der Kontrolle, den AMPH-Gruppen und dem Behandlungszeitpunkt zu testen.
- Automatisierte Analyse von SWIP
- Führen Sie eine automatisierte Analyse für jeweils einen einzelnen Wurm durch. Das Protokoll zum Einrichten der Kamera, die Wurm-Tracker-Software und das Skript zum Ausführen der Tracking-Software-Analyse sind in Hardaway et al. ausführlich beschrieben.
- Kurz gesagt, legen Sie einen einzelnen Hermaphroditen des späten L4-Stadiums mit einem Wimpernstocher in eine Glaspunktplatte, wie in der manuellen Methode in Abschnitt 1.1.2 beschrieben. Nehmen Sie Schwimmvideos von jeweils einem Wurm auf und verwenden Sie die Wurmtracker-Software, um die Häufigkeit von Körperbeugungen zu berechnen.
- Befolgen Sie das mit der Tracking-Software bereitgestellte Skript, um die Häufigkeit der Wurmschläge zu ermitteln und Heatmaps aus den Wurmschlagdaten zu erstellen.