RNAi-Plating für die Fütterung von C. elegans: Eine Technik zur Induktion der Ziel-dsRNA-Expression in E. coli

Zusammenfassung

Quelle: Kolundzic, E., et al. Anwendung von RNAi und Hitzeschock-induzierter Transkriptionsfaktorexpression zur Umprogrammierung von Keimzellen zu Neuronen in C. elegans. J. Vis. exp.(2018).

Dieses Video beschreibt die Prinzipien hinter der RNAi-Behandlung in C. elegans und demonstriert ein Protokoll zum Knockdown von lin-35 in einem transgenen Wurmstamm.

Protokoll

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Kolundzic, et al., Anwendung der RNAi- und Hitzeschock-induzierten Transkriptionsfaktorexpression zur Umprogrammierung von Keimzellen auf Neuronen in C. elegans, J. Vis. Exp. (2018).

1. Vorbereitung der Lösung
   1. NGM-Agar Platten (1 L)
      1. Fügen Sie 3 g NaCl, 2,5 g Peptonmedium (z. B. Bacto-Pepton) und 20 g Agar hinzu. Nach dem Autoklavieren fügen Sie 1 ml Cholesterin (5 mg/ml in 95% EtOH-Stamm), 1 ml 1 M MgSO₄, 1 ml 1 M CaCl2, 25 ml 1 M K2PO₄ und 1 ml Amphotericin B (2,5 mg/ml-Stamm) hinzu.
   2. NGM-Agar RNAi Platten (1 L)
      1. Fügen Sie 3 g NaCl, 2,5 g Peptonmedium und 20 g Agar hinzu. Nach dem Autoklavieren fügen Sie 1 ml Cholesterin (5 mg/ml in 95% EtOH-Stamm), 1 ml 1 M MgSO₄, 1 ml 1 M CaCl2, 25 ml 1 M K₂PO₄, 1 ml Amphotericin B (2,5 mg/ml) Brühe, 1 ml 1 M IPTG und 1 ml Carbenicillin (50 mg/ml) hinzu.
   3. LB-Agar (1 L)
      1. Fügen Sie 10 g Peptonmedien, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 20 g Agar, 10 ml 1 M Tris pH 8,0 hinzu. H₂O auf 1 L geben. Nach dem Autoklavieren 1 ml 50 mg/ml Carbenicillin und 2,5 ml 5 mg/ml Tetracyclin hinzufügen.
   4. LB Medium (1 L)
      1. Fügen Sie 10 g Peptonmedien, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl und 10 ml 1 M Tris pH 8,0 hinzu. H₂O auf 1 L geben. Nach dem Autoklavieren 1 ml 50 mg/ml Carbenicillin hinzufügen.
   5. M9-Puffer (1 L)
      1. Fügen Sie 6,0 g Na₂HPO₄, 3 g KH₂PO₄, 5 g NaCl und 50 mg Gelatine hinzu. Vor der Anwendung 1 mL 1 M MgSO₄ hinzufügen.
   6. Bleichlösung (10 mL)
      1. Fügen Sie 1 mL NaClO und 2 mL 5 N NaOH hinzu. Fügen Sie H2O zu 10 ml hinzu.
2. Vorbereitung von RNAi-Platten
   HINWEIS: C. elegans wird typischerweise im Labor auf 6 cm Petriplatten kultiviert, die 7,5 ml Nematoden Growth Medium Agar (NGM-Agar) enthalten. Dieses Protokoll ist für Würmer optimiert, die bei 15 °C gehalten werden. Um Platten mit NGM vorzubereiten, verwenden Sie sterile Standardtechniken, um eine Pilz- und Bakterienkontamination zu verhindern. Im Folgenden finden Sie das Protokoll zur Herstellung von NGM-Platten, die mit Reagenzien für RNAi ergänzt werden.
   1. Bereiten Sie 6-cm-NGM-Agar-RNAi-Platten vor, die 1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und 50 μg/ml Carbenicillin enthalten. Lassen Sie sie 24 – 48 h bei Raumtemperatur im Dunkeln^{trocknen 12}.
      1. Bewahren Sie RNAi-Platten bei 4 °C im Dunkeln auf. Nicht verwenden, wenn sie älter als 14 Tage sind.
   2. Wählen Sie den Klon des RNAi-Bakteriums (Escherichia coli HT115), der das Plasmid L4440 mit der DNA-Sequenz des Lin-53-Gens enthält, aus dem gefrorenen Glycerinbestand aus der verfügbaren RNAi-Bibliothek auf LB-Agarplatten, die 50 μg/ml Carbenicillin und 12,5 μg/ml Tetracyclin enthalten, unter Verwendung des Drei-Phasen-Streifenmusters. Züchten Sie die Bakterien über Nacht bei 37 °C. Dieser Klon ermöglicht die IPTG-abhängige Produktion von lin-53 dsRNA in den Bakterien.
      1. Darüber hinaus können RNAi-Bakterien, die das L4440-Plasmid enthalten, ohne dass eine Gensequenz als leere Vektorkontrolle vorhanden ist.
   3. Am nächsten Tag entnehmen Sie eine einzelne Kolonie aus lin-53 oder leeren Vektor-LB-Agarplatten mit einer 200 μl Pipettenspitze und inokulieren Sie jede von ihnen in ein separates Kulturröhrchen mit 2 mL flüssigem LB-Medium, ergänzt mit 50 μg/mL Carbenicillin. Züchten Sie die Kulturen über Nacht bei 37 °C, bis sie bei 600 nm eine optische Dichte (OD) von 0,6 – 0,8 erreichen. Messen Sie den Außendurchmesser mit einem Spektralphotometer.
      ACHTUNG: Das flüssige LB-Medium sollte im Gegensatz zu der LB-Agarplatte, die zum Abscheiden der Bakterien aus dem Glycerinbestand verwendet wird, kein Tetracyclin enthalten, da die Aufnahme von Tetracyclin während der Fütterung zu einer verminderten RNAi-Effizienz führt.
   4. Geben Sie 500 μl jeder Bakterienkultur (lin-53 oder leerer Vektor) mit einer Multipipette auf 6 cm NGM-Agar RNAi-Platten. Platten mit geschlossenem Deckel über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln zum Trocknen inkubieren. Während dieser Zeit induziert das IPTG in den NGM-Platten die Produktion von dsRNA in den Bakterien.
      1. Verwenden Sie mindestens 3 Platten pro Bakterienkultur und Experiment. Dadurch werden 3 technische Replikate für jedes Experiment bereitgestellt.
   • Getrocknete NGM-Agar-RNAi-Platten mit Bakterien bei 4 °C im Dunkeln bis zu zwei Wochen lagern.
3. Aufbereitung von C. elegans Stamm BAT28
4. Der Wurmstamm BAT28, der die Transgene otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] und ntIs1 [gcy-5prom::gfp] enthält, wird auf OP50-Bakterien mit Standard-NGM-Agar-Platten bei 15 °C gehalten.
   HINWEIS: Ein detailliertes Protokoll zur Nematodenkultur finden Sie unter. Das rol-6(su1006) ist ein dominantes Allel und häufig verwendeter phänotypischer Injektionsmarker¹⁶, der die typische Rollbewegung verursacht. Es wird im otIs305-Transgen verwendet, um hsp-16.2prom::che-1 zu verfolgen.
   1. Halten Sie den BAT28-Stamm immer bei 15 °C, um eine vorvorsichtige Aktivierung des hsp-16.2prom::che-1-Transgens zu verhindern. Reduzieren Sie die Exposition gegenüber Temperaturen über 15 °C und bewältigen Sie die Belastung so weit wie möglich.
5. Um das Alter von Würmern zu synchronisieren, verwenden Sie die Bleichtechnik.
   1. 6 cm NGM-Agar-Platten mit adulten und Eiern von BAT28 mit 900 μL M9-Puffer abwaschen. Pelletschnecken durch Zentrifugieren bei 900 x g für 1 min. Entfernen Sie den Überstand.
   2. Fügen Sie 0,5 – 1 ml Bleichlösung hinzu und schütteln Sie das Röhrchen ca. 1 Minute lang, bis adulte Würmer aufplatzen. Überwachen Sie mit einem Standard-Stereomikroskop.
   3. Pelletschnecken durch Zentrifugieren bei 900 x g für 1 Min. Den Überstand entfernen.
   4. Waschen Sie das Wurmpellet 3 Mal, indem Sie 800 μl M9-Puffer hinzufügen und bei 900 x g zentrifugieren.
   5. Legen Sie die gesäuberten Eier auf frische NGM-Platten, die mit OP50-Bakterien besiedelt sind. Züchten Sie eine gebleichte Population mit OP50-Bakterien bei 15 °C, bis sie das L4-Stadium erreichen (ca. 4 Tage). L4-Larven sind mit einem Standard-Stereomikroskop an einem weißen Fleck etwa auf halber Höhe der ventralen Seite des Wurms zu erkennen.
      HINWEIS: Um den Phänotyp der Umwandlung von Keimzellen in Neuronen nach Depletion von lin-53 zu erreichen, muss es in der elterlichen Generation (P0) depletiert werden. Die Bewertung des Konversionsphänotyps erfolgt in der folgenden Generation (Filialgeneration F1). Um den bereits im P0 vorhandenen Abbau von lin-53 zu erreichen, werden L4-Tiere RNAi unterzogen.
6. Übertragen Sie manuell 50 Würmer im L4-Stadium pro Replikat mit einem Platindraht auf eine NGM-Platte, die keine Bakterien enthält, und lassen Sie die Würmer von allen übertragenen OP50-Bakterien wegwandern. Lassen Sie die Würmer etwa 5 Minuten lang auf dem Teller wandern. Verwenden Sie Bakterien aus den NGM-Agar RNAi-Platten, die zuvor mit lin-53 RNAi-Bakterien besiedelt wurden (oder eine leere Vektorkontrolle), um sie auf die jeweiligen RNAi-Platten zu übertragen.
   1. Vermeiden Sie die Übertragung von OP50-Bakterien auf die eigentlichen RNAi-Platten. Arbeiten Sie schnell, um die Einwirkzeit der Dehnung bei Temperaturen über 15 °C zu minimieren.
7. Inkubieren Sie Würmer auf NGM-Agar-RNAi-Platten bei 15 °C für ca. 7 Tage, bis die F1-Nachkommen der Würmer das L3-L4-Stadium erreichen. Sie lassen sich deutlich von den P0-Tieren unterscheiden, da sie größer und dicker sind als die F1-Nachkommen.
   1. Überprüfen Sie visuell unter einem Standard-Stereomikroskop, ob F1-Nachkommenwürmer den Phänotyp der hervorstehenden Vulva (pvul) aufweisen, wie in Abbildung 1 gezeigt. RNAi gegen lin-53 hat pleiotrope Wirkungen und verursacht den pvul-Phänotyp, der zur Beurteilung des Erfolgs von RNAi gegen lin-53 herangezogen werden kann.
      HINWEIS: RNAi gegen lin-53 kann auch die Letalität von F1-Embryonen verursachen. Dieser Effekt verstärkt sich, wenn die Platten höheren Temperaturen als 15 °C ausgesetzt werden, bevor die Tiere das Stadium L3 – L4 erreicht haben. Tote Embryonen erkennt man an Entwicklungsstörungen und fehlendem Schlüpfen.
   2. Inkubieren Sie die Platten im Dunkeln, da IPTG lichtempfindlich ist.

Ergebnisse

Abbildung 1: Pvul-Phänotyp, der durch RNAi gegen lin-53 verursacht wird. (Oben) DIC-Bild von L4/jungadulten F1-Nachkommenwürmern, die von Kontroll- oder lin-53-RNAi-behandelten Müttern stammen. Maßstabsbalken = 20 μm. (Unten) Tiere, die mit lin-53 RNAi behandelt wurden, zeigen den Phänotyp der hervorstehenden Vulva (pvul) (schwarze Pfeilspitzen). Der pvul-Phänotyp ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Chemikalien
Agar-Agar, Kobe I	Roth	5210.1
Bactopepton	A. Hartenstein GmbH	Tel.: 211 677	Peptone Medien
Hefe-Extrakt	AppliChem	Nr. A1552,0100
Amphotericin B	USBilogisch	Nr. A2220
CaCl2	Merck Biowissenschaften	Artikel-Nr.: 208290
Cholesterin	Roth	Nr. 8866.2
Gelatine	Roth	4275,3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	Nr. T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	25.163.364
Na2HPO4	Roth	Nr. P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Carbenicillin	Roth	634412
Tetracyclin	Roth	2371,2
Inkubatoren
Inkubator	Sanyo MIR-5	5534210	zur Wartung von Schneckenstämmen bei 15 °C oder 25 °C
Mikroskope
Stereomikroskop	Nr. SMZ745	Nikon
Bakterielle Stämme
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 Polymerase) (IPTG-induzierbare T7 Polymerase) (RNAseIII minus).
Escherichia coli OP50			Uracil auxotropher E. coli-Stamm
Wurmstämme
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			abgeleitet von OH9846 durch 4x mehr Rückkreuzung mit N2
RNAi-Klone
LIN-53	QuelleBiowissenschaften	Kennung I-4D14	Ahringer-Bibliothek 16B07 ChromI, K07A1.12
leere Vetor: L4440	Addgene	#1654

kg kg kg kg kg