RNAi-Fütterung in Flüssigkultur: Eine Hochdurchsatzmethode zur Unterdrückung der Genexpression in C. elegans

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Groh et al., Methoden zur Untersuchung von Veränderungen in der inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter bei Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

>1. Flüssigkultur von gonadenlosen Tieren zur Sammlung junger und alter Tiere, die RNAi ausgesetzt sind, die auf ein Gen von Interesse abzielen

HINWEIS: Die Reaktion einiger Gene auf RNAi kann temperaturabhängig sein, wie zuvor beschrieben. Als Alternative zu RNAi könnte ein mutiertes Gen in den gon-2(-)-Hintergrund eingebaut werden.

1. Vorbereitung von Bakterien für die Flüssigkultur
   1. OP50- und RNAi-Bakterien (Bakterien, die die gewünschte dsRNA produzieren, und Bakterien mit dem leeren Vektor als Kontrolle) werden durch Beimpfen von 4 l LB-Medium mit 12 mL der jeweiligen Bakterienkultur (fügen Sie den RNAi-Bakterienkulturen eine Endkonzentration von 50 μg/mL Carbenicillin und 1 mM IPTG hinzu) und inkubieren Sie sie bei 37 °C über Nacht bei 180 U/min.
   2. Am nächsten Tag ernten Sie die Kulturen bei 6.700 x g für 10 min bei 4 °C. Entfernen Sie die Überstände und resuspendieren Sie jedes Pellet in 60 mL eiskaltem S Basalmedium (100 mM NaCl, 50 mM Kaliumphosphat pH 6, auf Eis gelagert). Die drei resuspendierten Pellets (OP50, Kontroll-RNAi-Bakterien und RNAi-Bakterien für das gewünschte Gen) werden bis zu Schritt 1.2.
      bei 4 °C gehalten. HINWEIS: Würmer können auf RNAi aus dem L1-Stadium oder zur Vermeidung von Entwicklungsdefekten aus dem letzten Larvenstadium L4 gezüchtet werden (siehe Schritt 1.2).
2. Flüssigkultur zur Behandlung mit RNAi ab dem letzten Larvenstadium L4
   1. Geben Sie 200 mL S Basalmedium in einen Fernbach-Kulturkolben (Fassungsvermögen 2.800 mL). Für ein endgültiges Kulturvolumen von 300 ml (siehe 1.2.2.4) werden 10 mM Kaliumcitrat, pH 6, 3 ml Spurenmetalllösung (5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 2,5 mM FeSO₄, 1 mM MnCl₂, 1 mM ZnSO₄, 0,1 mM CuSO₄), 3 mM MgSO₄, 3 mM CaCl₂, 100 ng/ml Carbendazim und 5 μg/ml Cholesterin zugegeben. Der Kolben wird mit einem Membranschraubverschluss verschlossen. In Tabelle 1 finden Sie Rezepte für Puffer.
   2. Nehmen Sie die L1s aus 25 °C und übertragen Sie sie auf 15 mL Röhrchen. Bei 1.900 x g für 3 min zentrifugieren, den Überstand entfernen und die L1s pro 2 μl zählen. 500.000 L1 in den im vorherigen Schritt vorbereiteten Fernbach-Kulturkolben geben.
   3. Fügen Sie OP50 (aus Schritt 1.1) proportional zur Anzahl der Würmer hinzu. Fügen Sie z. B. für 500.000 Würmer 60 ml OP50 hinzu.
   4. Komplette Wurmkultur mit S basal, um das Gesamtvolumen auf 300 ml zu bringen. Inkubieren Sie die Wurmkultur bis zum L4-Stadium bei 25 °C in einem Schüttelbrutkasten mit 150 U/min.
   5. Am nächsten Tag sollten die Würmer die Größe von Wildtyp L4 haben. Um von OP50- auf RNAi-Bakterien umzusteigen, sammeln Sie die Tiere in sechs 50-ml-Röhrchen, lassen Sie sie sedimentieren und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die L4s mit M9, um OP50-Restbakterien zu entfernen: zentrifugieren Sie bei 1900 x g für 3 min, entfernen Sie den Überstand und geben Sie alle L4s in ein 50 mL-Röhrchen. Zählen Sie die L4s pro 5 μl (mindestens neunmal). Für die Entnahme junger Würmer werden zweimal 50.000 L4 und für die Entnahme gealterter Würmer zweimal 100.000 L4 benötigt.
   6. Vier Fernbach-Kulturflaschen werden wie in Abschnitt 1.2.2.1 beschrieben vorbereitet. Außerdem wird in jeden Kolben eine Endkonzentration von 50 μg/ml Carbenicillin und 1 mM IPTG gegeben.
   7. Fügen Sie Kontroll-RNAi-Bakterien und RNAi-Bakterien für das interessierende Gen (aus Schritt 1.1) proportional zur Anzahl der Würmer hinzu: Fügen Sie 7 mL der jeweiligen Bakterien pro Flasche für junge Würmer und 14 mL pro Flasche für die gealterten Würmer hinzu.
   8. Fügen Sie 50.000 Würmer pro Flasche für die Sammlung junger Würmer und 100.000 Würmer pro Flasche für die Sammlung gealterter Würmer hinzu und vervollständigen Sie die Kulturen mit S basal, um bis zu 300 ml zu füllen. Inkubieren Sie die Wurmkulturen (insgesamt vier) bei 25 °C und 150 U/min.

2. Pflege von C. elegans-Flüssigkulturen

1. Entnehmen Sie in regelmäßigen Abständen ein Aliquot aus jeder Flüssigkultur und legen Sie es auf einen Objektträger (alternativ auf eine Agarplatte), um sicherzustellen, dass keine Kontaminationen vorhanden sind. Überprüfen Sie mit einem Präpariermikroskop den Gehalt an bakteriellen Lebensmitteln in der Kultur, insbesondere während der Wachstumsphase. Bereiten Sie im Voraus 2 L Kulturen von Kontroll-RNAi-Bakterien und RNAi-Bakterien für das gewünschte Gen vor, wie in Schritt 1.1 beschrieben. Diese bei Bedarf in C. elegans-Flüssigkulturen geben und den Rest bei 4 °C halten.
2. Überprüfen Sie regelmäßig, ob die Tiere steril sind. Die meisten Tiere haben keine Keimdrüse. Abhängig von der Penetranz der gon-2-Mutation können einige abortierte Gonadenstrukturen haben, aber es sollten keine Tiere mit Eiern beobachtet werden.

Tabelle 1.