RNAi-Fütterung in Flüssigkultur: Eine Hochdurchsatzmethode zur Unterdrückung der Genexpression in C. elegans

Zusammenfassung

Quelle: Groh, N. et al. Methoden zur Untersuchung von Veränderungen in der inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter bei Caenorhabditis elegans. J. Vis.(2017).

RNAi ist ein mächtiges genetisches Werkzeug, das C. elegans-Forschern zur Verfügung steht. In diesem Video wird eine Methode vorgestellt, mit der mehr Würmer mit RNAi behandelt werden können als mit der Plattenfütterung unter Verwendung von Flüssigkulturbedingungen.

Protokoll

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Groh et al., Methoden zur Untersuchung von Veränderungen in der inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter bei Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

>1. Flüssigkultur von gonadenlosen Tieren zur Sammlung junger und alter Tiere, die RNAi ausgesetzt sind, die auf ein Gen von Interesse abzielen

HINWEIS: Die Reaktion einiger Gene auf RNAi kann temperaturabhängig sein, wie zuvor beschrieben. Als Alternative zu RNAi könnte ein mutiertes Gen in den gon-2(-)-Hintergrund eingebaut werden.

1. Vorbereitung von Bakterien für die Flüssigkultur
   1. OP50- und RNAi-Bakterien (Bakterien, die die gewünschte dsRNA produzieren, und Bakterien mit dem leeren Vektor als Kontrolle) werden durch Beimpfen von 4 l LB-Medium mit 12 mL der jeweiligen Bakterienkultur (fügen Sie den RNAi-Bakterienkulturen eine Endkonzentration von 50 μg/mL Carbenicillin und 1 mM IPTG hinzu) und inkubieren Sie sie bei 37 °C über Nacht bei 180 U/min.
   2. Am nächsten Tag ernten Sie die Kulturen bei 6.700 x g für 10 min bei 4 °C. Entfernen Sie die Überstände und resuspendieren Sie jedes Pellet in 60 mL eiskaltem S Basalmedium (100 mM NaCl, 50 mM Kaliumphosphat pH 6, auf Eis gelagert). Die drei resuspendierten Pellets (OP50, Kontroll-RNAi-Bakterien und RNAi-Bakterien für das gewünschte Gen) werden bis zu Schritt 1.2.
      bei 4 °C gehalten. HINWEIS: Würmer können auf RNAi aus dem L1-Stadium oder zur Vermeidung von Entwicklungsdefekten aus dem letzten Larvenstadium L4 gezüchtet werden (siehe Schritt 1.2).
2. Flüssigkultur zur Behandlung mit RNAi ab dem letzten Larvenstadium L4
   1. Geben Sie 200 mL S Basalmedium in einen Fernbach-Kulturkolben (Fassungsvermögen 2.800 mL). Für ein endgültiges Kulturvolumen von 300 ml (siehe 1.2.2.4) werden 10 mM Kaliumcitrat, pH 6, 3 ml Spurenmetalllösung (5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 2,5 mM FeSO₄, 1 mM MnCl₂, 1 mM ZnSO₄, 0,1 mM CuSO₄), 3 mM MgSO₄, 3 mM CaCl₂, 100 ng/ml Carbendazim und 5 μg/ml Cholesterin zugegeben. Der Kolben wird mit einem Membranschraubverschluss verschlossen. In Tabelle 1 finden Sie Rezepte für Puffer.
   2. Nehmen Sie die L1s aus 25 °C und übertragen Sie sie auf 15 mL Röhrchen. Bei 1.900 x g für 3 min zentrifugieren, den Überstand entfernen und die L1s pro 2 μl zählen. 500.000 L1 in den im vorherigen Schritt vorbereiteten Fernbach-Kulturkolben geben.
   3. Fügen Sie OP50 (aus Schritt 1.1) proportional zur Anzahl der Würmer hinzu. Fügen Sie z. B. für 500.000 Würmer 60 ml OP50 hinzu.
   4. Komplette Wurmkultur mit S basal, um das Gesamtvolumen auf 300 ml zu bringen. Inkubieren Sie die Wurmkultur bis zum L4-Stadium bei 25 °C in einem Schüttelbrutkasten mit 150 U/min.
   5. Am nächsten Tag sollten die Würmer die Größe von Wildtyp L4 haben. Um von OP50- auf RNAi-Bakterien umzusteigen, sammeln Sie die Tiere in sechs 50-ml-Röhrchen, lassen Sie sie sedimentieren und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die L4s mit M9, um OP50-Restbakterien zu entfernen: zentrifugieren Sie bei 1900 x g für 3 min, entfernen Sie den Überstand und geben Sie alle L4s in ein 50 mL-Röhrchen. Zählen Sie die L4s pro 5 μl (mindestens neunmal). Für die Entnahme junger Würmer werden zweimal 50.000 L4 und für die Entnahme gealterter Würmer zweimal 100.000 L4 benötigt.
   6. Vier Fernbach-Kulturflaschen werden wie in Abschnitt 1.2.2.1 beschrieben vorbereitet. Außerdem wird in jeden Kolben eine Endkonzentration von 50 μg/ml Carbenicillin und 1 mM IPTG gegeben.
   7. Fügen Sie Kontroll-RNAi-Bakterien und RNAi-Bakterien für das interessierende Gen (aus Schritt 1.1) proportional zur Anzahl der Würmer hinzu: Fügen Sie 7 mL der jeweiligen Bakterien pro Flasche für junge Würmer und 14 mL pro Flasche für die gealterten Würmer hinzu.
   8. Fügen Sie 50.000 Würmer pro Flasche für die Sammlung junger Würmer und 100.000 Würmer pro Flasche für die Sammlung gealterter Würmer hinzu und vervollständigen Sie die Kulturen mit S basal, um bis zu 300 ml zu füllen. Inkubieren Sie die Wurmkulturen (insgesamt vier) bei 25 °C und 150 U/min.

2. Pflege von C. elegans-Flüssigkulturen

1. Entnehmen Sie in regelmäßigen Abständen ein Aliquot aus jeder Flüssigkultur und legen Sie es auf einen Objektträger (alternativ auf eine Agarplatte), um sicherzustellen, dass keine Kontaminationen vorhanden sind. Überprüfen Sie mit einem Präpariermikroskop den Gehalt an bakteriellen Lebensmitteln in der Kultur, insbesondere während der Wachstumsphase. Bereiten Sie im Voraus 2 L Kulturen von Kontroll-RNAi-Bakterien und RNAi-Bakterien für das gewünschte Gen vor, wie in Schritt 1.1 beschrieben. Diese bei Bedarf in C. elegans-Flüssigkulturen geben und den Rest bei 4 °C halten.
2. Überprüfen Sie regelmäßig, ob die Tiere steril sind. Die meisten Tiere haben keine Keimdrüse. Abhängig von der Penetranz der gon-2-Mutation können einige abortierte Gonadenstrukturen haben, aber es sollten keine Tiere mit Eiern beobachtet werden.

Stammlösung	Menge	Endkonzentration	Kommentare/Beschreibung
S basal (Für 500 mL: 5,9 g NaCl, 50 mL 1 M Kaliumphosphat pH 6)	200 mL		1 M Kaliumphosphat pH 6: Für 1 L: 129 g KH2PO4 monobasisch, 52 g K2HPO4 zweibasisch wasserfrei
1 M Kaliumcitrat pH 6 (Für 400 mL: 13,1 g Zitronensäuremonohydrat, 134,4 g Trikaliumcitrat-Monohydrat)	3 mL	ca. 10 mM
Spurenmetalle Lösung (Für 1 L: 1,86 g Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,69 g FeSO4 · 7 H2O, 0,2 g MnCl2 · 4 H2O, 0,29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0,025 g CuSO4 · 5 H2O)	3 mL		Lagere Stammlösung im Dunkeln bei 4 °C
1 M MgSO4 (für 500 mL: 123,3 g)	900 μL	3 mM
1 M CaCl2 (für 500 mL: 73,5 g)	900 μL	3 mM
200 μg/mL Carbendazim (Für 50 ml: 10 mg in Methanol)	150 μL	100 ng/ml
5 mg/ml Cholesterin (Für 100 mL: 0,5 g Ethanol)	300 μL	5 μg/ml

Tabelle 1.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kulturflasche Fernbach	Corning	4425-2XL	Pyrex, Fassungsvermögen 2.800 ml, mit 3 Blendeneinkerbungen	ja
Membran-Schraubverschluss	Schott	1E+06	GL45	ja
Nutierender Mischer	VWR	444-0148		ja
Scheidetrichter	Nalgene	4300-1000	Fassungsvermögen 1.000 ml	Nein
1 ml Spritze	BD Plastipak	3E+05		Nein
Graunadel, 27 G x 1/2 ", 0,4 mm x 13 mm	BD Mikrolanze 3	3E+05		Nein
Membranfilter 0,025 μM	Millipore	VSWP04700		Nein
pH-Streifen	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14	Nein
Protease-Inhibitor-Cocktail	Roche	5E+09	Komplette Mini-EDTA-freie Tabletten	Nein
Octoxynol-9	Applichem	Nr. A1388	Triton X-100	Nein
4-Morpholineethansulfonsäure (MES)	Sigma-Aldrich	Nr. M1317		Nein
Nonylphenylpolyethylenglykol	Applichem	Nr. A1694	Nonidet P40 (NP40)	Nein
DNaseI	Roche	5E+09	rekombinant, RNase-frei	Nein
RNaseA	Promega	Nr. A7973	Lösung	Nein
Färbung des Gesamtprotein-Blots	Thermofischer	Nr. S11791	Sypro Ruby Protein-Blot-Färbung	Nein
Färbung des Gesamtproteingels	Thermofischer	Nr. S12001	Sypro Ruby Protein Gel Färbung	Nein
TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphinhydrochlorid)	Serva	Artikel-Nr.: 36970		Nein
Jodacetamid	Serva	Artikel-Nr.: 26710		Nein
Ammoniumbicarbonat	Sigma-Aldrich	9830		Nein
Modifiziertes Trypsin in Sequenzierungsqualität	Promega	Nr. V5111		Nein
Isobare Tags für die relative und absolute Quantifizierung	Sciex	4E+06	iTRAQ Reagenzien Multiplex-Kit	Nein
Zentrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	4E+05		ja
Ultrazentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	4E+05		Nein
Zentrifuge 5424R	Eppendorf	5E+09		ja
Zentrifuge 5702	Eppendorf	6E+09		ja
Zentrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	8E+07		Nein
Konzentrator Plus	Eppendorf	5E+09	Zentrifugalverdampfer	Nein
Fluoreszierendes Stereomikroskop M165 FC	Leica		Mit Planapo 2.0x Objektiv	Nein
Mikroskop zum Sezieren	Leica		Leica S6E	ja
Mikroskop mit hoher Vergrößerung Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		Mit PlanAPOCHROMAT 20x Objektiv und Zeiss Axio Cam MRm	Nein
Software				Nein
Bildanalyse-Software	BildJ			Nein
Analyse von massenspektrometrischen Daten	Protein-Prospektor		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	Nein
E.coli-Stämme
OP50	CGC
RNAi-Bakterien
Nr. L4440	Julie Ahringer RNAi-Bibliothek
C. elegans-Mutanten
CF2253	CGC, Stammname: EJ1158		Genotyp: gon-2(q388)
C. elegans transgene Stoffe
DCD214	Della Davids Labor am DZNE Tübingen		Genotyp: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
DCD215	Della Davids Labor am DZNE Tübingen		Genotyp: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]