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Vier-Wege-Olfaktometer-Assay: Eine Methode zur Bewertung von Geruchsreaktionen bei Drosophila

30. April 2023

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Quelle: Lin, C.C., et al. Olfaktorisches Verhalten durch Computer-Tracking von Drosophila in einem Vier-Quadranten-Olfaktometer. J. Vis. Exp. (2016).

Fruchtfliegen haben ein komplexes Geruchssystem, können Hunderte von Geruchsstoffen unterscheiden und ihren Geruchssinn nutzen, um Verhaltensentscheidungen zu treffen. Dieses Video beschreibt den Vier-Wege-Olfaktometer-Assay, eine Methode zur Untersuchung olfaktorischer Verhaltensreaktionen bei Fliegen. Der vorgestellte Protokollclip zeigt, wie man mit Testfliegen umgeht und was die kritischen Schritte bei der Durchführung des Assays sind.

Protokoll

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Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Lin et al., Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer, J. Vis. Exp. (2016).

1. Verhaltensreaktionen auf attraktive und abstoßende Geruchsstoffe

  1. Schalten Sie den Temperaturregler ein und stellen Sie ihn auf 25 °C ein.
  2. Verbinden Sie die Odoriermittelkammern (Kontroll- und Prüfodoriermittel), indem Sie den Schlauch in den Auslass der Odoriermittelkammer und in die Steckverbindung an der Verhaltensbox einführen.
  3. Überprüfen Sie die Durchflussrate in jedem Quadranten mit dem Luftmassenmesser, um sicherzustellen, dass die Kontroll- und Odoriermittelströme 100 ml/min betragen.
  4. Reinigen Sie die PTFE Fly Arena und die Glasplatten 2-3 Mal mit 70% Ethanol und lassen Sie sie vollständig an der Luft trocknen (~3-4 min).
  5. Befestigen Sie die Glasplatten mit Klammern an der Arena.
  6. Fliegen ohne CO2 -Betäubung durch das Loch in einer der Glasplatten in die Arena bringen. Legen Sie nach dem Transfer ein kreisförmiges Netz auf das Loch, um zu verhindern, dass Fliegen entweichen.
    HINWEIS: Es hat sich gezeigt, dass eine CO2 -Anästhesie das Verhalten von Drosophila beeinflusst und sollte nicht innerhalb von 24 Stunden nach einem Verhaltensexperiment angewendet werden.
  7. Platzieren Sie die Arena mit den Fliegen in der lichtdichten Kammer, verbinden Sie die vier Steuerluftströme, indem Sie den Schlauch, der an der Steckverbindung an der Verhaltensbox befestigt ist, mit den Arenaecken verbinden, schließen Sie die Tür der Kammer und warten Sie 10-15 Minuten, bis sich die Fliegen an die neue Umgebung gewöhnt haben. Wenn möglich, schalten Sie das Licht in dem Raum aus, in dem die Experimente durchgeführt werden, um mögliche minimale Lichtlecks zu vermeiden, die das Versuchsergebnis verfälschen könnten.
  8. Führen Sie ein 5-10-minütiges Kontrollexperiment durch, bei dem die Fliegen 4 Kontrollluftströmen ausgesetzt werden.
  9. Analysieren Sie die Daten sofort (siehe Abschnitt Datenanalyse unten), um sicherzustellen, dass die Fliegen gleichmäßig in der Arena verteilt sind und der Anziehungsindex nahe 0 liegt. Dieser Schritt ist unerlässlich, da er sicherstellt, dass es innerhalb der Arena keine unkontrollierten Quellen der Bevorzugung oder Vermeidung gibt (z. B. von außen austretendes Licht, ungleichmäßige Temperaturverteilung, ungleichmäßige Arena, Geruchskontamination usw.). Wenn die Fliegen ungleichmäßig verteilt sind oder ihre Bewegungsaktivität gering ist, werfen Sie die Fliegen weg, reinigen Sie die Arena erneut (Schritt 1.4) und verwenden Sie eine neue Charge Fliegen, um das Experiment zu wiederholen.
  10. Verbinden Sie die Prüfodormittelkammer mit dem Aufbau, indem Sie die 3-Wege-Ventile einschalten oder die Anschlussschläuche wieder einstecken.
  11. Führen Sie das Testexperiment 5-10 Minuten lang durch und analysieren Sie die Daten wie in Abschnitt 2 unten beschrieben (Abbildung 1). Aufzeichnungen, die länger als 20 Minuten sind, können zu Datendateien führen, die rechnerisch schwer zu verarbeiten sind. Wenn längere experimentelle Aufzeichnungen gewünscht sind, stoppen Sie das Tracking-Programm schnell und starten Sie es neu. Dies führt zu einer Lücke von ~10 Sekunden zwischen den experimentellen Aufnahmen.
  12. Fliegen wegwerfen.
  13. Reinigen Sie die Arena und die Glasplatten mit 70 % Ethanol (Schritt 1.4) und tauschen Sie die Verbindungsrohre in das lichtdichte Gehäuse aus. Um Experimente zu beschleunigen, kann eine neue saubere Arena verwendet werden, und die schmutzige Arena kann während der Durchführung von Versuchsläufen gereinigt werden.
  14. Führen Sie bei Bedarf ein weiteres Experiment mit einer neuen Charge Fliegen durch. Wenn mehrere Versuche am selben Tag durchgeführt werden, achten Sie äußerst darauf, dass kein Odormittel aus einem früheren Testlauf im System verbleibt. Dies ist normalerweise kein Problem bei niedrigen Konzentrationen von Odorierstoffen oder bei CO2, aber für hochkonzentrierte Stimuli kann ein Abstand von bis zu 24 Stunden zwischen den Versuchsläufen erforderlich sein. Darüber hinaus können alle Schläuche nach den Durchflussschläuchen ausgetauscht werden, wenn bei Kontrollversuchen der Verdacht auf eine Odormittelkontamination besteht. Lassen Sie die trockene Luft zwischen den Versuchen immer eingeschaltet, um das System kontinuierlich zu spülen.

2. Datenanalyse

HINWEIS: Die vorgeschlagene Fliegenverfolgungssoftware (detailliert in den Materialien) verfolgt Fliegen in Echtzeit während der Erfassung und speichert den Zeitstempel und die Koordinaten aller erkannten Fliegen im *.dat-Format. Wir haben eine maßgeschneiderte Matlab-Routine entwickelt, um die Daten in ein Matlab-Format zu konvertieren und zu analysieren. Codebeispiele sind in den ergänzenden Materialien enthalten, aber Einzelheiten zur Implementierung hängen von der Software ab, die für die Datenerfassung verwendet wird.

  1. Laden Sie die Rohdaten. Erstellen Sie eine räumliche Maske, die den Konturen der Arena folgt, und wenden Sie die Maske auf die Rohdaten an, um alle Datenpunkte zu entfernen, die außerhalb der Arena liegen, da sie Rauschen darstellen (Abbildung 2A, Ergänzender Code MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask.m).
  2. Entfernen Sie alle Datenpunkte, die sich länger als 3s mit einer Geschwindigkeit unter 0,163 cm/s bewegen, da es sich bei diesen Daten wahrscheinlich um Rauschen handelt oder von nicht bewegten Fliegen erzeugt wird (Abbildung 2B, Ergänzender Code TemporalFiltering.m).
  3. Visualisieren Sie verbleibende Datenpunkte, indem Sie sie alle auf einmal oder als einzelne Trajektorien darstellen (Abbildung 1, Ergänzender Code SingleTrajectoryViewer.m).
    HINWEIS: Die Position der Geruchsgrenzen in den vier Feldern hängt wahrscheinlich von einer Reihe von Faktoren ab, wie z. B. den Eigenschaften jedes Odormittels und den verwendeten Luftdurchsätzen. Zum Beispiel füllen leicht flüchtige Geruchsstoffe den Geruchsquadranten wahrscheinlich vollständiger aus als weniger flüchtige Geruchsstoffe. Daher ist es wahrscheinlich, dass jeder Geruchsstoff leicht unterschiedliche Geruchsgrenzen aufweisen kann. Die Verwendung eines Photoionisationsdetektors zur Messung von Geruchsgrenzen kann problematisch sein, da er ein Vakuum verwendet, um Luft von einer bestimmten Stelle zu entnehmen, und so die Geruchsmittelkonzentration an dieser Stelle stört. Nichtsdestotrotz können Geruchsgrenzen auf der Grundlage von Verhaltensdaten von Fliegen schnell abgeschätzt werden. Zum Beispiel kann eine Geruchsgrenze, die auf kumulierten Fliegenspuren als Reaktion auf verschiedene Gerüche basiert, deutlich in Abbildung 1C und 1D beobachtet werden.
  4. Berechnen Sie einen Anziehungsindex, um zu bestimmen, ob Kontrollexperimente keine Präferenzreaktion hervorrufen, und um auf die Reaktion auf einen Geruchsreiz (oder optogenetischen) Stimulus zuzugreifen. Um einen Attraction Index (AI) zu berechnen, verwenden Sie die letzten 5 Minuten einer Kontroll- oder Testaufzeichnung. Um ein Maß für die Anziehung zu erhalten, das zwischen +1 (absolute Anziehung) und -1 (absolute Abstoßung) liegt, wird die folgende Formel zur Berechnung der AI verwendet:
    figure-protocol-1
    Dabei ist Ntest die Anzahl der Datenpunkte im Testquadranten, Ncontrol ist die durchschnittliche Anzahl der Datenpunkte in den drei Kontrollquadranten. Dieses Maß ist intuitiv, da keine Präferenz durch Werte nahe Null angezeigt wird. Es zeigt jedoch nicht korrekt an, wie hoch der Anteil an der Gesamtzahl der Fliegen ist, die sich im Odorantenquadranten befinden. Um dieses Maß zu erhalten, kann ein prozentualer Index (PI) verwendet werden:
    figure-protocol-2
    Dabei ist Ntest die Anzahl der Datenpunkte im Testquadranten und Ngesamt die Gesamtzahl der Datenpunkte in allen vier Quadranten. Diese Formel liefert ein Maß, das zwischen 0 und 1 liegt, wobei 0,25 keiner Verhaltenspräferenz entspricht (Abbildung 1E und 2C, Ergänzender Code AttractionIndex.m).
  5. Führen Sie 5-10 Wiederholungen jeder Versuchsbedingung durch, wobei für jede Wiederholung eine neue Gruppe von Fliegen verwendet wird. Vergleichen Sie die Anziehungsindizes zwischen Bedingungen oder mit Kontrollen, indem Sie den nichtparametrischen Kolmogorov-Smirnov-Test verwenden (Abbildung 1F, kstest2-Funktion in Matlab).

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Ergebnisse

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figure-results-1
Abbildung 1: Beispieldaten, die mit einem vierfeldrigen Geruchstest generiert wurden. (A) Schematische Darstellung der Vier-Feld-Arena. (B) Neutrale Reaktionen werden beobachtet, wenn alle vier Quadranten nur Trockenluftperfusion enthalten. (C) Anziehungsreaktionen auf eine 6,25%ige Verdünnung von Apfelessig, der aus dem linken oberen Quadranten perfundiert wurde. (

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Luftzufuhrsystem(Benötigte Menge)
Schläuche und Verbinder
Thermoplastische NPT(F)-VerteilerCole-Parmer, IL, Vereinigte Staaten von AmerikaNr. R-31522-311
Sechskant-Reduziernippel (1/4MNPT->1/8MNPT)McMaster-Carr, IL, Vereinigte Staaten von AmerikaArtikel-Nr.: 5232T3141
Schläuche (ID:1/8)McMaster-Carr, IL, Vereinigte Staaten von AmerikaArtikel-Nr.: 5108K4350 Ft
Schläuche (ID:1/16)McMaster-Carr, IL, Vereinigte Staaten von AmerikaArtikel-Nr.: 52355K41100 Ft
Rohrverschraubungen mit StachelMcMaster-Carr, IL, Vereinigte Staaten von AmerikaArtikel-Nr.: 5117K711 Packung
Rohrverschraubungen zum Schieben nach AnschlussMcMaster-Carr, IL, Vereinigte Staaten von AmerikaArtikel-Nr.: 5779K1024
Rohrverschraubungen mit Widerhaken (1/4MNPT->1/8BF)McMaster-Carr, IL, Vereinigte Staaten von AmerikaArtikel-Nr.: 5463K4391 Packung (10)
Rohrverschraubungen mit Widerhaken (1/8MNPT->1/8BF)McMaster-Carr, IL, Vereinigte Staaten von AmerikaArtikel-Nr.: 5463K4382er Pack (10)
Rohrverschraubungen mit Widerhaken (1/8MNPT->1/16BF)McMaster-Carr, IL, Vereinigte Staaten von Amerika5463K42er Pack (10)
Rohrverschraubungen mit Widerhaken (1/4MNPT->1/4BF)McMaster-Carr, IL, Vereinigte Staaten von AmerikaArtikel-Nr.: 5670K841
Sechskant-SteckerMcMaster-Carr, IL, Vereinigte Staaten von AmerikaArtikel-Nr.: 48335K1521
Luftdruckregler, Luftfilter und Durchflussmesser(Benötigte Menge)
Laboratorische GastrocknungsanlageW A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKAArtikel-Nr.: L68-NP-303; Bestand #268401
Mehrrohrrahmen für 150 mm DurchflussrohreCole-Parmer, IL, Vereinigte Staaten von AmerikaNr. R03215-301
Mehrrohrrahmen für 150 mm DurchflussrohreCole-Parmer, IL, Vereinigte Staaten von AmerikaNr. R03215-761
150 mm DurchflussrohreCole-Parmer, IL, Vereinigte Staaten von AmerikaNr. R-03217-159
Ventil-KartuscheCole-Parmer, IL, Vereinigte Staaten von AmerikaNr. R-03218-729
Präzisions-LuftreglerMcMaster-Carr, IL, Vereinigte Staaten von AmerikaArtikel-Nr.: 6162K131
MagnetventileAutomatisieren Sie Scientific, Berkeley, Kalifornien02-10i4
Steuerung des MagnetventilsValveLink 8.2, Automatisierung der Wissenschaft, Berkeley, Kalifornien18-Januar1
Elektronischer DurchflussmesserHoneywellAWM3100V1
DATENERFASSUNG (NI USB-6009, National Instruments) undNationale InstrumenteNI USB-60091
StromversorgungExtech InstrumentsArtikel-Nr.: 3822001
Geruchskammern
Weithalsglas aus Polypropylen 2 oz; 60 mlNalgeneArtikel-Nr.: 562118-0002Pro Versuch sind mindestens 5 erforderlich, aber für jede Verdünnung jedes Odoriermittels ist eine separate Kammer erforderlich. Erhältlich im Container Store, Teil #635114)
Geruchskammer aus Glas, 0,25 ozSunburst FlascheLB4BMindestens 5 sind pro Versuch erforderlich
"In"-Ventil für GeruchskammerSmart Products, Inc., Kalifornien, USAArtikel-Nr.: 214224PB-0011S000-40741 dieser Teile wird pro Geruchskammer verwendet, muss aber häufig ausgetauscht werden
"Out"-Ventil für die GeruchskammerSmart Products, Inc., Kalifornien, USAArtikel-Nr.: 224214PB-0011S000-40741 dieser Teile wird pro Geruchskammer verwendet, muss aber häufig ausgetauscht werden
O-RingRT Dygert International, MN, Vereinigte Staaten von AmerikaAS568-029 Buna-N O-R1 Packung (100)
Flugarena, Kamera und Verhaltensboxen(Benötigte Menge)
Verhalten und Material der KameraboxInterstate plastics, CA, USAABS schwarz extrudiert (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)1803 Quadratzoll
Teflon für Fliegenarena- und Geruchskammereinsätze, 3/8" dick, 12" x 12"McMaster-Carr, IL, Vereinigte Staaten von AmerikaArtikel-Nr.: 8545K271
Glasplatten, 1/8" dick, 9" x 9"McMaster-Carr, IL, Vereinigte Staaten von AmerikaArtikel-Nr.: 8476K191arabische Ziffer
Dual-wirkender thermoelektrischer ReglerWAtronix Inc., CA, Vereinigte Staaten von AmerikaDA12V-K-01
IR-LED-AnordnungErweiterte Beleuchtung, Rochester, VT, USAAL4554-88024, PS24-TL2 LED-Arrays und ein Netzteil
KlimaanlageMelcor StoreMAA280T-121
Bildgebendes System(Benötigte Menge)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12,5 mm F/1,4) C-Mount ObjektivB AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USAPEC21211 KP1
CCXC-12P05N VerbindungskabelB AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USASOCCXC12P05N1
DC-700 Kamera-AdapterB AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USASODC7001
B+W 40,5 093 IR-FilterB AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USAArtikel-Nr.: 65-0724421
TiFFEN 40,5 mm ZirkularpolarisatorAmazonas1
IR-VideokameraQuelle für industrielle Bildverarbeitung, FL, USASony XC-EI50 (SY-XC-E150)1
USB-VideokonverterThe Imagingsource, NC, USADFG/USB2-IT1
iFlySpy2 (Software zur Flugverfolgung)Julian Brown, Stanford, Kalifornien: julianrbrown@gmail.comiFlySpy21
IC-ErfassungssoftwareThe Imagingsource, NC, USA(http://www.theimagingsource.com/)
Verschiedenes(Benötigte Menge)
Dremel RotationswerkzeugDremel, Racine, WI, USADremel 8000-031
Diamantbeschichtete Bohrer zum Schneiden von GlasErhältlich von verschiedenen Lieferanten; MSC industrial Supply Co, Melville, NY906063281

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Schlagwörter

Drosophila VerhaltenOlfaktorischer AssayFliegen TrackingLuftstromsteuerungQuadrant OlfaktometerVerhaltensanalyseGeruchsabgabesystemExperimentelles Protokoll

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