Drosophila Y-Labyrinth-Assay: Eine Methode zur Beurteilung von Geruchsreaktionen bei Fliegen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Simonnet, M. M., et al. Test des Drosophila-Geruchssinns mit einem Y-Labyrinth-Assay. J. Vis. Exp. (2014).

Dieses Video beschreibt eine Methode zum Testen des olfaktorischen Erkundungsverhaltens bei der Fruchtfliege, das sogenannte Y-Labyrinth. Der vorgestellte Protokollclip zeigt, wie der Assay eingerichtet und durchgeführt wird.

Protokoll

Dieser Protokolltext ist ein Auszug aus Simonnet et al., Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay, J. Vis. Exp. (2014).

1. Vor dem Start

Verwenden Sie einen isogenisierten Referenzstamm mit stabilen und robusten Verhaltensphänotypen. Es gibt keine allgemeingültige Regel für die Auswahl dieses Bestands, da alle potenziellen Kontrollen heterogene Hintergrundallele tragen können.
Verwenden Sie diesen Kontrollstamm, um alle anderen Rohlinge rückkreuzen, die für spätere Schritte erforderlich sind. Dieser Rückkreuzungsschritt wird typischerweise durch mindestens 5 aufeinanderfolgende Kreuzungen einer einzelnen jungfräulichen Hündin (um eine mögliche Kreuzung zwischen homologen Chromosomen zu ermöglichen) mit 2–3 isogenen Referenzmännchen dargestellt. Dieser Schritt ist wichtig, um den genetischen Hintergrund zwischen den verschiedenen Fliegenbeständen zu homogenisieren.
Halten Sie die Drosophila-Bestände auf einem Standard-Maismehl (9 %), Hefe (10 %) und Agarmedium (1,5 %), ergänzt mit Antibiotikum (0,4 % Methyl-para-hydroxy-benzoat) in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei 25 °C.
Durchführung chemosensorischer Experimente in einem temperaturkontrollierten Raum (25 °C) unter dunkelrotem Licht (um den Beitrag visueller Signale zu eliminieren und sich auf chemosensorische Signale zu konzentrieren). Erneuern Sie regelmäßig die Luft im Raum, um den Bereich zwischen den einzelnen Experimenten zu lüften.

2. Geruchsreaktion mit einem Y-Labyrinth-Assay

Lassen Sie die Fliegen vor dem Test 16–18 Stunden bei 25 °C in Glasröhrchen mit nassem Papiertuch aushungern.
Verbinden Sie einen Y-förmigen Verbinder mit zwei Glasfläschchen und mit einem kleineren Kunststofffläschchen (Ladefläschchen). Verwenden Sie 1 ml Pipettenspitzen, die durch die Schaumstoffstopfen geführt werden, um den Anschluss mit den drei Fläschchen zu verbinden und ein dicht verschlossenes Y-Labyrinth zu erhalten. Schneiden Sie die schmalen Enden von zwei Pipettenspitzen (~2 mm Durchmesser, um ein Wiederzurückkehren der Fliege zu vermeiden, sobald sie ihre Entscheidung getroffen hat) ab, um zwei "Fallen"-Fläschchen zu bilden, und ein großes Ende einer Pipettenspitze, um das "Lade"-Röhrchen zu bilden (Abbildung 1A).
Legen Sie kurz vor dem Anschließen der "Trap"-Fläschchen (Abbildung 1B) ein Filterpapier mit ~6 mm Durchmesser in jedes Fläschchen. Geben Sie 40 μl Odorierlösung auf ein Filterpapier und 40 μl des entsprechenden Lösungsmittels auf das zweite Filterpapier.
Geben Sie zehn 4 bis 9 Tage alte Fliegen in das "Lade"-Fläschchen. Verwenden Sie während dieses Transfers keine CO₂ -Anästhesie, da diese einen starken Einfluss auf das Verhalten hat. Lieber eine kurze Abkühlung auf Eis verwenden. Die richtige Handhabung von betäubten Fliegen ist wichtig, um den Stress für die Probanden so gering wie möglich zu halten.
1. Führen Sie eine Reihe von Y-Labyrinth-Tests bei 25 °C unter dunkelrotem Licht durch (mit LED-Lampen, um mögliche Wärmequellen zu begrenzen), um visuelle Reize so weit wie möglich zu vermeiden. Achten Sie darauf, die Ausrichtung der Y-Labyrinthe zu wechseln (Odormittel-haltiges Rohr links oder rechts und Laderohr vorne oder hinten; Abbildung 1C).
2. Warten Sie einige Stunden, bis die Fliegen in das Fallenfläschchen mit dem Odorierungsmittel oder dem Lösungsmittel gelangt sind. Die Zählung fliegt nach 24 Stunden, um die Beteiligung auf über 80% zu erhöhen und den maximalen olfaktorischen Indexwert zu liefern (Simonnet, persönliche Mitteilung).
3. Berechnen Sie den resultierenden Geruchsindex mit der folgenden Formel: (Zahl in der Geruchsröhre - Zahl in der Lösungsmittelröhre)/Gesamtzahl der geladenen Fliegen.
Waschen Sie das Y-Labyrinth-Setup wie folgt: Weichen Sie das demontierte Setup über Nacht in RBS 35 MD ein. Gründlich mit Leitungswasser ausspülen. Zum Schluss mit entionisiertem Wasser abspülen und trocknen lassen.

3. Statistische Analyse der Daten

Führen Sie je nach Daten und Variablen einen t-Test, eine unidirektionale ANOVA oder eine bidirektionale ANOVA durch.

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Ergebnisse

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Abbildung 1: Männliche Geruchsreaktion, gemessen mit einem Y-Labyrinth-Setup. A) Split-Gerät. B) Zusammengebautes Gerät. C) Aufstellung im betriebsbereiten Zustand bei hellrotem Licht. D) Quantifizierung der männlichen Geruchsreaktionen auf Essigsäure (AA) oder Phenylessigsäure (PAA), beide in destilliertem Wasser verdünnt (10% v/v) (N = 11, entsprich...