Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Brust-Mascher und Scholey, Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo, J. Vis. Exp. (2009).
Rezepte:
Traubensaftplatten:
- 5,5 g Bacto Agar
- 14,5 g Dextrose oder Glukose
- 7,15 g Saccharose
- 45 ml Traubensaftkonzentrat (100% Saft).
- 204,5 ml H20
- 625 μl 10N NaOH
Alle Zutaten mischen und in der Mikrowelle erhitzen, bis sie kochen.
2,8 ml Säuremischung zugeben (Säuremischung: 20,9 ml Propionsäure, 2,1 ml Phosphorsäure, 27 ml H20)
Mischen und auf 35 mm Petrischalen gießen. Ein bis zwei Tage bei Raumtemperatur fest werden lassen. Wenn die Platten nicht bald verwendet werden, mit Parafilm versiegeln und bei 4 °C aufbewahren (vor der Verwendung auf RT ausgleichen lassen).
Hefepaste:
Lösen Sie etwa einen Teelöffel Hefe (Sigma YSC2, Hefe aus Saccharomyces cerevisiae Typ II) in Wasser auf, um eine dicke Paste zu bilden. Geben Sie eine kleine Menge davon auf jede Traubensaftplatte kurz vor der Verwendung.
Injektionspuffer:
- 150 mM K-Aspartat
- 10 mM K-Phosphat
- 20 mM Imidazol, pH 7,2
Heptan Kleber:
Rollen Sie das doppelte Klebeband ab und geben Sie es in eine 100-ml-Flasche, fügen Sie etwa 50 ml Heptan hinzu, verschließen Sie die Flasche und rocken Sie mehrere Tage lang. Füge bei der Verwendung Heptan hinzu, wenn der Kleber zu dickflüssig ist.
Dehydrationskammer:
Nehmen Sie eine 100 mm Petrischale, legen Sie einen Teil einer 35 mm Schale hinein, um einen "Tisch" zu machen, und fügen Sie Drierit (wasserfreies Kalziumsulfat) hinzu, so dass die Höhe des Drierits nicht höher als der "Tisch" und die Abdeckung ist. Das Deckglas mit den Embryonen wird zur Dehydrierung vor der Injektion auf diesen "Tisch" gelegt. Es ist eine gute Idee, zumindest etwas anzeigendes Drierit zu verwenden und es zu ändern, wenn es seine Farbe geändert hat.
Protokoll:
Dieses Protokoll kann für die Injektion praktisch jedes löslichen Reagenzes in den Drosophila-Synzytial-Embryo verwendet werden: Zum Beispiel entweder ein fluoreszierendes Protein für die Beobachtung oder einen Zielprotein-Inhibitor oder beides.
1. Entnahme von Embryonen
- Lege eine neue Traubensaftplatte auf den Legekäfig.
- Entfernen Sie diese Platte nach einer Stunde, dies ist die erste Entnahme des Tages und oft nicht sehr gut. Es kann verworfen werden.
- Wechsle die Platte jede Stunde, um jeweils eine Stunde lang Embryonen zu sammeln.
2. Vorbereitung des Deckglases
- Legen Sie ein 50 x 22 mm großes Deckglas auf eine Seite eines Objektträgers. Klebe die vier Ecken an die Rutsche, damit sie sich nicht bewegt.
- Tragen Sie mit einem Applikator mit Wattespitze eine Schicht Heptankleber in einer Linie auf das Deckglas auf (der Kleber sollte nicht viskos sein und in wenigen Sekunden trocknen, andernfalls fügen Sie mehr Heptan hinzu).
- Kleben Sie ein Stück doppeltes Klebeband auf die Rutsche an der Seite des Deckglases.
3. Vorbereitung des Embryos
HINWEIS: Embryonen sollten etwa 2 Stunden nach Beginn der Entnahme abgebildet werden, beginnen Sie also mit den folgenden Schritten und lassen Sie genügend Zeit, um sie innerhalb dieses Zeitrahmens zu beenden.
- Mit einer angefeuchteten Bürste die Embryonen vorsichtig von der Traubensaftplatte aufnehmen und auf doppeltes Klebeband auf den Objektträger legen.
- Rollen Sie die Embryonen mit dem äußeren Teil der Pinzette über das doppelte Klebeband, bis das Chorion (die äußere Membran) aufbricht.
- Nehmen Sie den Embryo auf, indem Sie ihn vorsichtig über das Chorion rollen, so dass er an der Pinzette klebt, und legen Sie ihn auf den Heptankleber auf dem Deckglas, wobei die lange Seite des Embryos parallel zur langen Seite des Deckglases verläuft. Setze 10 bis 20 Embryonen in einer Reihe ein.
- Entfernen Sie das Deckglas und legen Sie es für 3 bis 8 Minuten in die Dörrkammer (dies hängt von der Luftfeuchtigkeit des Raumes und der zu injizierenden Menge ab).
- Auf eine Metallkammer mit Vakuumfett legen.
- Bedecken Sie die Embryonen mit Halogenkohlenwasserstofföl 700, um eine weitere Austrocknung zu vermeiden. Die Embryonen sind nun bereit für die Injektion.
4. Injektion von Embryonen
- Finden Sie die Embryonen unter einem 16-fachen Ziel.
- Bewegen Sie die Embryonen weg und finden Sie die Nadel, ohne die Brennebene zu bewegen.
- Zentrieren Sie die Nadel und bewegen Sie sie nach oben, ohne sie in x- oder y-Richtung zu bewegen.
- Wenn die Nadel nicht geöffnet ist, legen Sie die Kante des Deckglases in das Sichtfeld, aber nicht an die Stelle, an der sich die Nadel befindet, und senken Sie die Nadel auf die gleiche Brennebene ab. Bewegen Sie das Deckglas sehr vorsichtig, bis es auf die Nadel trifft und sie vorsichtig aufbricht. Wenn die Nadel geöffnet ist, fahren Sie mit Schritt 5 fort. (Die Nadeln können vor dem Befüllen mit Flusssäure geöffnet werden).
- Platzieren Sie die Embryonen in Sichtweite (aber nicht dort, wo die Nadel sein wird), senken Sie die Nadel in das Öl und stellen Sie sicher, dass Sie schöne Flüssigkeitstropfen aus der Nadel erhalten.
- Bewegen Sie den Embryo vorsichtig, aber stetig in die Nadel, injizieren Sie einen Tropfen in den Embryo und bewegen Sie den Embryo weg. (Oder befolgen Sie die Anweisungen Ihres Injektionsgeräts).
- Nachdem alle Embryonen injiziert wurden, sind sie bereit für die Betrachtung am Konfokalmikroskop.
