Light Spot Assay: Eine Methode zur Untersuchung des phototaktischen Verhaltens von Drosophila

Zusammenfassung

Quelle: Sun, Y., et al. Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis. J. Vis. Exp. (2019).

Drosophila-Larven sind lichtempfindlich und reagieren auf Veränderungen des Umgebungslichts. Dieses Video beschreibt einen Assay, der ihre Fähigkeit testet, Licht zu vermeiden, den sogenannten Lichtfleck-Assay. Das vorgestellte Protokoll zeigt, wie der Assay mit einer Blaulicht-LED eingerichtet wird, und zeigt, wie das Verhalten des Tieres als Reaktion auf die Lichtbegegnung aufgezeichnet wird.

Protokoll

Dieser Protokolltext ist ein Auszug aus Sun et al., Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis, J. Vis. Exp.(2019).

1. Aufbau des Bildgebungssystems

1. Klemmen Sie eine hochauflösende Webcam mit einem Eisenclip etwa 10 cm über dem Lichtfleck auf dem Schreibtisch fest (Abbildung 1).
2. Stellen Sie die Ausrichtung des Kameraobjektivs auf den Schreibtisch ein. Schließen Sie die Kamera über eine USB-Schnittstelle an einen Computer an.
3. Platzieren Sie eine Agarplatte auf dem Schreibtisch direkt unter der Kamera.
4. Öffnen Sie die Software "Amcap9.22" auf dem Computer mit Windows 7, und der Lichtfleck wird automatisch im Fenster von AMcap angezeigt. Bewegen Sie die Kamera leicht nach links oder rechts, um sicherzustellen, dass sich der Lichtpunkt in der Mitte des Fensters befindet. Stellen Sie sicher, dass die Kamera den Lichtweg nicht blockiert. Der Lichtfleck sollte vollständig und rund sein.
   HINWEIS: Die Software finden Sie unter http://amcap.en.softonic.com/.
5. Befestigen Sie einen 850 nm ± 3 nm Bandpassfilter mit einem Clip bei 5-7 mm direkt unter der Kamera.
   HINWEIS: Der Durchmesser des Filters beträgt ca. 2,5 cm und das Kameraobjektiv hat einen Durchmesser von weniger als 1 cm, sodass der Filter das Sichtfeld der Kamera abdecken kann. Mit dem Filter unterhalb der Kamera sollte der Lichtfleck im Fenster von AMcap nicht zu sehen sein.
6. Platzieren Sie drei infrarotlicht erzeugende LEDs (zentrale Wellenlänge = 850 nm) gleichmäßig um die Agarplatte. Jede LED sollte etwa 5 cm vom Rand der Agarplatte entfernt sein, und die Linsenfläche der LED sollte in einem Winkel von 70° nach unten zur Agarplatte stehen. Schließen Sie die LEDs über den AC/DC-Wandler an die Stromversorgung an.
   HINWEIS: Es ist besser, die Positionen und Winkel der Infrarotlicht-LEDs zu fixieren, um die Konsistenz der Helligkeit des Feldes in verschiedenen experimentellen Versuchen zu gewährleisten und die spätere Videoverarbeitung zu erleichtern.
7. Platzieren Sie eine Tafel zwischen dem Computer und dem Gerät. Stellen Sie die Helligkeit des Computerbildschirms ein, um zu verhindern, dass das Licht des Computerbildschirms das Experiment beeinträchtigt.
   HINWEIS: Halten Sie die Umgebung dunkel, wenn Sie die Wellenlänge oder Intensität des Lichts messen.

2. Festlegen von Parametern für die Bildgebung

1. Wählen Sie im Menü der AMcap-Software Optionen | Videogerät | Erfassen Sie das Format, und legen Sie die Pixelgröße des aufgenommenen Videos auf 800 x 600 und die Bildrate auf 60 fps fest.
2. Entfernen Sie den Filter unter der Kamera, legen Sie ein Lineal unter die Kamera und stellen Sie den Kamerafokus so ein, dass die Skalenlinie klar und parallel zur Breite des Videosichtfelds verläuft.
3. Klicken Sie auf Erfassen | Einrichten | Videoaufnahme, um den Speicherpfad auszuwählen, klicken Sie auf Aufnahme starten, zeichnen Sie die tatsächliche Entfernung auf, die 600 Pixeln entspricht, und berechnen Sie das Verhältnis der einzelnen Pixel zur tatsächlichen Entfernung.

3. Videoaufzeichnung des Lichtvermeidungsverhaltens

1. Halten Sie bei allen Versuchen eine Temperatur von 25,5 °C aufrecht. Kontrollieren Sie die Raumtemperatur bei Bedarf mit einer Klimaanlage. Halten Sie die Luftfeuchtigkeit mit einem Luftbefeuchter konstant bei 60 %.
2. Machen Sie ein kurzes Video von der Position des Lichtpunkts mit dem Namen "lightarea1". Verschieben Sie dann den Filter von 850 nm ± 3 nm zurück, um das Kameraobjektiv abzudecken.
   HINWEIS: Bei der Aufzeichnung des Larvenverhaltens wird das Kameraobjektiv mit dem 850 nm ± 3 nm Filter abgedeckt, so dass der Lichtfleck im Video nicht zu sehen ist. Der Lichtfleck kann später mit Matlab in Videos mit Larven rekonstruiert werden. Ändern Sie nicht die Position der Kamera und vermeiden Sie es, das Verhältnis der einzelnen Pixel zur tatsächlichen Entfernung zu ändern, die in Schritt 2.3 gemessen wurde.
3. Schalten Sie ein Licht (z. B. ein Raumlicht) ein, das weit vom Versuchsgerät entfernt ist. Drehen Sie das Licht so leise wie möglich herunter, solange die Larven mit den Augen deutlich zu sehen sind. Nehmen Sie die Larven mit einem Löffel aus dem Nährmedium, pflücken Sie vorsichtig eine Larve des dritten Stadiums und waschen Sie sie mit destilliertem Wasser sauber. Achten Sie darauf, die Larven einzeln zu waschen, um Störungen durch Hunger zu vermeiden. Für einen einzigen Versuch werden mindestens 20 Larven benötigt.
4. Übertragen Sie die Larve in die Mitte der Agarplatte, die in Schritt 1.3 unter der Kamera platziert wurde. Entfernen Sie vorsichtig überschüssiges Wasser von der Larve mit einer Bürste oder verwenden Sie Löschpapier, um Wasser aus der Larve zu entfernen, um eine Reflexion des Lichts unter der Linse zu verhindern. Schalten Sie das Raumlicht aus und lassen Sie die Larve sich 2 Minuten lang in der dunklen Umgebung akklimatisieren.
5. Schalten Sie das LED-Licht ein, um Infrarotlicht zu erzeugen, und bürsten Sie die Larve vorsichtig in die Mitte der Platte. Wenn die Larve anfängt, gerade zu kriechen, drehen Sie die Platte, so dass die Larve auf den Lichtfleck zusteuert. Achten Sie darauf, dass er von Anfang an gerade kriecht, sonst kann es sein, dass er keinen Zugang zum Lichtfleck erhält.
6. Klicken Sie auf Erfassen | Einrichten | Videoaufnahme, um den Speicherpfad auszuwählen, und klicken Sie dann auf Aufnahme starten, um aufzunehmen. Lassen Sie die Larve in Richtung des Lichtflecks kriechen, betreten Sie den Lichtfleck und verlassen Sie den Lichtfleck, bis er fast aus dem Sichtfeld ist. Klicken Sie auf Aufzeichnung beenden. Wenn sich die Larve vom Lichtfleck abwendet, bevor sie sich nähert, klicken Sie direkt auf Aufnahme stoppen.
7. Bewegen Sie den Filter von der Kamera weg. Machen Sie ein kurzes Video von der Position des Lichtflecks mit dem Namen "lightarea2" und vergleichen Sie es mit "lightarea1", um sicherzustellen, dass die Position des Lichtflecks nicht geändert wird. Wenn eine offensichtliche Positionsänderung beobachtet wird, verwerfen Sie die Daten.

Ergebnisse

Abbildung 1: Versuchsaufbau. (A) Schematische Darstellung des Aufbaus für den lichtpunktbasierten Larven-Schnellphototaxis-Assay. Die blauen Linien stellen die Pfade des sichtbaren Lichts dar, das als visuelle Stimulation verwendet wird, und die roten Linien stellen die Pfade des Infrarotlichts dar. Pfeile geben die Richtung des Lichts an. Der 850-nm-Bandpassfilter lässt Infrarotlicht durch, blockiert...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
850 nm ± 3 nm infrarotlicht erzeugende LED	Thorlabs, Vereinigte Staaten von Amerika	PM100A	Kompatible Sensoren: Fotodiode und Thermal Optischer Leistungsbereicha: 100 pW bis 200 W Verfügbarer Sensorwellenlängenbereicha: 185 nm-25 μm Bildwiederholfrequenz des Displays: 20 Hz Bandbreite: DC-100 kHz Fotodioden-Sensorbereichb: 50 nA-5 mA Thermopile-Sensorbereichb: 1 mV-1 V
AC/DC-Wandler	Thorlabs, Vereinigte Staaten von Amerika	S120VC	Blendengröße: Ø9,5 mm Wellenlängenbereich: 200-1100 nm Leistungsbereich: 50 nW-50 mW Detektortyp: Si-Fotodiode (UV-erweitert) Linearität: ±0,5% Messunsicherheit: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
Bandpass-Filter	Thorlabs, Vereinigte Staaten von Amerika	DC2100	LED-Strombereich: 0-2 A LED-Stromauflösung: 1 mA LED-Stromgenauigkeit: ±20 mA LED-Durchlassspannung: 24 V Modulationsfrequenzbereich: 0-100 kHz Sinuswelle Modulation: Willkürlich
Kollimiertes blaues LED-Licht	ELP, China	USBFHD01M	Max. Auflösung: 1920x1080 F6,0 mm Sensor: 1/2,7" CMOS OV2710
Kompakte Powermeter-Konsole	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Abmessungen: 89,1 mm x 63,3 mm x 34,4 mm Gewicht: 190 g Detektor: Sony ILX511B (lineares Silizium-CCD-Array mit 2048 Elementen) Wellenlängenbereich: 200-850 nm Integrationszeit: 1 ms – 65 Sekunden (20 Sekunden typisch) Dynamikumfang: 8,5 x 10^7 (System); 1300:1 für eine einzelne Erfassung Signal-Rauschabstand: 250:1 (Vollsignal) Dunkelrauschen: 50 RMS counts Gitter: 2 (250 – 800 nm) Schlitz: SLIT-50 Detektor-Sammellinse: L2 Sortierung: OFLV-200-850 Optische Auflösung: ~2,0 nm FWHM Streulicht: <0,05 % bei 600 nm; <0,10 % bei 435 nm LWL-Steckverbinder: SMA 905 auf 0,22 numerische Apertur einsträngige Faser
Hochleistungs-LED-Treiber	Minhongshi, China	MHS-48XY	Betriebsspannung: DC12V Zentrale Wellenlänge: 850 nm
Hochauflösende Webcam	Thorlabs, Vereinigte Staaten von Amerika	MWWHL4	Farbe: Warmweiß Korrelierte Farbtemperatur: 3000 K Prüfstrom für typische LED-Leistung: 1000 mA Maximaler Strom (CW): 1000 mA Bandbreite (FWHM): N/A Elektrische Leistung: 3000 mW Betrachtungswinkel (Vollwinkel): 120° Emittergröße: 1 mm x 1 mm Typische Lebensdauer: >50 000 h Betriebstemperatur (nicht kondensierend): 0 bis 40 °C Lagertemperatur: -40 bis 70 °C Risikogruppea: RG1 – Gruppe mit niedrigem Risiko
LED Warmweiß	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25,4(+0~-0,1) mm Bandbreite: 22±3nm Spitzendurchlässigkeit: 80% Zentrale Wellenlänge: 850 nm±3 nm
Spektrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap ist eine Foto- und Videoaufnahmeanwendung mit erweiterten Vorschau- und Aufnahmefunktionen. Es handelt sich um eine Desktopanwendung, die für Computer mit Windows 7 SP1 oder höher entwickelt wurde. Die meisten Video-for-Windows- und DirectShow-kompatiblen Geräte werden unterstützt, unabhängig davon, ob es sich um billige Webcams oder fortschrittliche Video-Capture-Karten handelt.
Standard-Leistungssensor für Fotodioden	Super Dragon, China	YGY-122000	Eingang: AC 100-240V ~ 50 / 60Hz 0,8A Ausgang: DC 12V 2A
Thermischer Leistungssensor	Thorlabs, Vereinigte Staaten von Amerika	M470L3-C1	Farbe: Blau Nennwellenlänge a: 470 nm Bandbreite (FWHM): 25 nm Maximaler Strom (CW): 1000 mA Durchlassspannung: 3,2 V Elektrische Leistung (max.): 3200 mW Emittergröße: 1 mm x 1 mm Typische Lebensdauer: 100 000 h Betriebstemperatur (nicht kondensierend): 0 bis 40 °C Lagertemperatur: -40 bis 70 °C Risikogruppe b: RG2 – Moderate Risikogruppe
Thermischer Leistungssensor	Thorlabs, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. S401C	Wellenlängenbereich: 190 nm-20 μm Optischer Leistungsbereich: 10 μW-1 W (3 Wb) Größe der Eingangsblende: Ø10 mm Aktive Melderfläche: 10 mm x 10 mm Maximale optische Leistungsdichte: 500 W/cm2 (Durchschnitt) Linearität: ±0,5%