Saggio spot leggero: un metodo per indagare sul comportamento fototattico della Drosophila

Overview

Le larve di Drosophila sono sensibili alla luce e rispondono ai cambiamenti nella luce circostante. Questo video descrive un saggio che mette alla prova la loro capacità di evitare la luce, chiamato test del punto luce. Il protocollo in primo piano dimostra come impostare il test con un LED a luce blu e mostra come registrare il comportamento dell'animale in risposta all'incontro con la luce.

Protocol

Questo testo del protocollo è un estratto da Sun et al., Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis, J. Vis. Exp.

1. Configurazione del sistema di imaging

1. Bloccare una webcam ad alta risoluzione con una clip di ferro, a circa 10 cm sopra il punto luce sul desktop (Figura 1).
2. Regolare l'orientamento dell'obiettivo della fotocamera verso il desktop. Collegare la fotocamera a un computer tramite un'interfaccia USB.
3. Posizionare una piastra di agar sul desktop proprio sotto la fotocamera.
4. Apri il software "Amcap9.22" sul computer con Windows 7 e il punto luce verrà visualizzato automaticamente nella finestra di AMcap. Spostare la fotocamera leggermente a sinistra o a destra per assicurarsi che il punto luce si trova vicino al centro della finestra. Assicurarsi che la fotocamera non blocchi il percorso della luce. Il punto luce dovrebbe essere completo e rotondo.
   NOTA: Il software è disponibile all'indirizzo http://amcap.en.softonic.com/.
5. Correggere un filtro passa banda da 850 nm ± a 3 nm con una clip a 5-7 mm proprio sotto la fotocamera.
   NOTA: Il diametro del filtro è di circa 2,5 cm e l'obiettivo della fotocamera ha un diametro inferiore a 1 cm, in modo che il filtro possa coprire il campo visivo della fotocamera. Con il filtro sotto la fotocamera, il punto luce non deve essere visto nella finestra di AMcap.
6. Posizionare tre LED generatori di luce infrarossa (lunghezza d'onda centrale = 850 nm) uniformemente attorno alla piastra dell'agar. Ogni LED dovrebbe essere a circa 5 cm di distanza dal bordo della piastra dell'agar e la faccia dell'obiettivo del LED dovrebbe essere ad un angolo verso il basso di 70 ° verso la piastra dell'agar. Collegare i LED all'alimentazione tramite il convertitore DA AC a DC.
   NOTA: È meglio fissare le posizioni e gli angoli dei LED a luce infrarossa per garantire la coerenza della luminosità del campo in varie prove sperimentali e facilitare l'elaborazione video successiva.
7. Metti una lavagna nera tra il computer e il dispositivo. Impostare la luminosità dello schermo del computer per evitare che la luce dello schermo del computer influenzi l'esperimento.
   NOTA: Mantenere l'ambiente buio quando si misura la lunghezza d'onda o l'intensità della luce.

2. Impostazione dei parametri dell'imaging

1. Scegliere Opzioni dal menu del software AMcap | Dispositivi video | Acquisire ilformato e impostare la dimensione in pixel del video acquisito su 800 x 600 e la frequenza fotogrammi su 60 fps.
2. Rimuovere il filtro da sotto la fotocamera, mettere un righello sotto la fotocamera e regolare la messa a fuoco della fotocamera per rendere la linea di scala chiara e parallela alla larghezza del campo visivo video.
3. Fare clic su Acquisisci | Configurare | Acquisizione video per selezionare il percorso di salvataggio, fare clic su Avviaregistrazione , registrare la distanza effettiva corrispondente a 600 pixel e calcolare il rapporto tra ogni pixel e la distanza effettiva.

3. Registrazione video del comportamento di elusione della luce

1. Mantenere una temperatura di 25,5 °C attraverso tutti gli esperimenti. Controllare la temperatura ambiente con un condizionatore d'aria, se necessario. Mantenere l'umidità costantemente al 60% con un umidificatore.
2. Scatta un breve video della posizione del punto luce chiamato "lightarea1". Quindi, spostare il filtro da 850 nm ± 3 nm per coprire l'obiettivo della fotocamera.
   NOTA: Quando si registra il comportamento larvale, l'obiettivo della fotocamera è coperto dal filtro da 850 nm ± 3 nm in modo che il punto luce non sia mostrato nel video. Il punto luce può essere ricostruito in video con larve più tardi con Matlab. Non modificare la posizione della fotocamera ed evitare di modificare il rapporto tra ogni pixel e la distanza effettiva misurata nel passaggio 2.3.
3. Accendere una luce (cioè una luce ambiente) lontana dal dispositivo sperimentale. Abbassare la luce il più in basso possibile, purché le larve possano essere chiaramente viste con gli occhi. Togliere le larve dal mezzo di coltura con un cucchiaio, raccogliere delicatamente una larva della terza stella e lavarla pulita con acqua distillata. Fai attenzione a lavare la larva una alla volta per evitare interferenze dalla fame. Un singolo esperimento richiede almeno 20 larve.
4. Trasferire la larva al centro della piastra di agar posta sotto la fotocamera durante il passaggio 1.3. Rimuovere delicatamente l'acqua in eccesso dalla larva con un pennello o utilizzare carta assorbente per rimuovere l'acqua dalla larva per evitare il riflesso della luce sotto l'obiettivo. Spegnere la luce della stanza e consentire alla larva di acclimatarsi per 2 minuti nell'ambiente buio.
5. Accendere la luce LED per generare luce infrarossa e spazzolare delicatamente la larva al centro della piastra. Quando la larva inizia a strisciare dritta, ruota la piastra per far testare la larva verso il punto luce. Assicurarsi che striscia direttamente dall'inizio, altrimenti potrebbe non ottenere l'accesso al punto luce.
6. Fare clic su Acquisisci | Configurare | Acquisizione video per selezionare il percorso di salvataggio, quindi fare clic su Avvia registrazione per registrare. Consentire alla larva di strisciare verso il punto luce, entrare nel punto luce, quindi lasciare il punto luce fino a quando non è quasi fuori dal campo visivo. Fare clic su Interrompi registrazione. Se la larva si allontana dal punto luce prima di avvicinarsi, fare clic direttamente su Interrompi registrazione.
7. Allontanare il filtro dalla fotocamera. Scatta un breve video della posizione del punto luce chiamato "lightarea2" e confrontalo con "lightarea1" per assicurarti che la posizione del punto luce non sia cambiata. Se si osserva un evidente cambiamento di posizione, scartare i dati.

Representative Results

Figura 1: Creazione sperimentale. (A) Rappresentazione schematica dell'insieme per il saggio di fototassi veloce larvale a base di macchia luminosa. Le linee blu rappresentano i percorsi della luce visibile utilizzati come stimolazione visiva e le linee rosse rappresentano i percorsi della luce infrarossa. Le frecce indicano la direzione della luce. Il filtro passa banda da 850 nm consente il passaggio della luce infrarossa, ma blocca la luce visibile. (B) Immagine dell'insieme per il saggio del punto luce. Va notato che l'immagine è stata scattata in condizioni di luce per una migliore visualizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidth: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920x1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120° Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%